李 伟，吴 刚，薛荣亮

(西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科，陕西 西安 710004)

在脑缺血再灌注损伤中，程序性细胞死亡即凋亡是脑缺血再灌注损伤神经元死亡的主要方式，对其机制的研究是目前的热点。研究[1]表明：细胞凋亡受多种基因调控，Bcl-2与p53被认为是最重要的调控基因。p53可调节多种基因的转录，参与DNA复制与损伤修复，诱导凋亡。所以，p53及其相关基因的表达已成为目前脑缺血再灌注损伤神经元死亡的关键环节。Bcl-2是凋亡重要调控基因，目前认为，Bcl-2可抑制细胞凋亡，其家族基因在调节线粒体通透性中发挥重要作用。在脑缺血再灌注损伤中Bcl-2对p53表达有无影响尚未见相关研究报道。因此，本研究利用过度表达Bcl-2的大鼠，研究其脑缺血再灌注后P53蛋白的表达，探讨Bcl-2的抗凋亡作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂4%多聚甲醛、磷酸盐缓冲液(PBS)及Poly-Lysene多聚赖氨酸(北京中山生物制品公司)，P53检测试剂盒(美国Santa Gruz Biotechnology公司)，原位未端标记细胞凋亡试剂盒(美国 Oncogene试剂公司)，Bcl-2检测试剂盒(北京中山生物制品公司)。

1.2 动物模型的制备及分组雄性健康SD大鼠90只，由西安交通大学医学院动物中心提供，体质量为(300±20) g。随机分为3组(n=30)：假手术组(SO组)、缺血再灌注组(IR组)和Bcl-2过度表达组(Bcl-2组)。

Bcl-2组模型利用西北农林科技大学生命科学院生物技术室hbcl-2 cDNA克隆载体，设计引物序列为： 5′-CTCGAGTATGGCGCAAGCCGGGAG,3′-GCGGCCGCTCACTTGTGGCCCAGG-TATGCACC，进行PCR扩增。PCR产物纯化后，与pLNCX2进行双酶切，并用T4DNA连接酶定向连接，构建逆转录病毒载体pLN-Bcl。脂质体Lipofectamine 2000转染法将该载体导入包装细胞PT-67，筛选阳性细胞克隆，进一步培养，收集和浓缩病毒液，最后测定病毒滴度。……