应用EST－ILPs分子标记技术快速鉴定菟丝子属种子

2012-09-28郭琼霞黄可辉

植物保护 2012年6期

关键词：检测

郭琼霞，庄蓉，2，黄振，黄可辉，2＊

（1.福建出入境检验检疫局，福州 350001；2.福建农林大学植物保护学院，福州 350002）

近年来，分子标记已广泛应用于遗传图谱构建、基因克隆、基因定位、遗传多样性分析、基因组比较、标记辅助育种等方面的研究［1－3］。由于EST来源于编码区，内含子位置通常较为保守；而不同种或地理亚种间的内含子长度又存在差异，故用它建立的ILPs分子标记在种间鉴定上具有优越性。采用ILPs（intron length polymorphisms）分子标记在菟丝子属的分类鉴定上国内外均未见报道。因此本研究利用旋花科（Convolvulaceae）番薯属（Ipomoea）的EST（expressed sequence tags，Tags，表达序列标签）序列，通过网站（http：∥ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／index.html）查找内含子和外显子，然后根据网站自动设计的引物，再对9个菟丝子的样品进行引物的筛选，寻找种间特异性条带从而达到分类鉴定的目的。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验选用菟丝子属（Cuscuta）5个近似种（含不同的地理型）的种子作为研究材料。各个种的种子材料来源详见表1。

表1 材料来源

1.2 总DNA的提取与凝胶电泳检测

1.2.1 菟丝子总DNA的提取

选取菟丝子的种子为材料，采用SDS法提取总 DNA［4］。

1.2.2 凝胶电泳检测

采用高必达等［5］设计的一对能检测ITS序列的特异性引物：A1（5′－TCGTAACAAGGTTTCCGTAG－3′）与 A2（5′－AGGAGGCCAGGATCTATT－3′）进行PCR扩增。扩增体系为：25μL（10×PCR buffer，25mmol／L MgCl2，10mmol／L dNTP，5 U／μL Taq DNA 聚合酶，10μmol／L 引物，模板DNA约为100ng／μL）。反应程序为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃7min。扩增产物经1.5%琼脂糖电泳分离，检测400～500bp左右的扩增片段。从而根据电泳图上此扩增片段的有无判断是否提取出DNA。