油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

2012-09-28张慧丽王建峰段维军高姗姗陈先锋

植物保护 2012年6期

张慧丽，王建峰，段维军，徐瑛，高姗姗，陈先锋＊

（1.宁波出入境检验检疫局，宁波 315012；2.宁波大学，宁波 315211）

华丽腐霉（Pythium splendens Braun）引起的油棕猝倒病是油棕上的一种重要真菌病害［1］，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕苗以外，还能危害上百种经济作物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫［2］。它主要分布在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、日本、坦桑尼亚、刚果和美国的夏威夷、佛罗里达、宾夕法尼亚州，国内台湾、海南曾有报道［2－4］，但其他地区未见发生报道。该病菌通过带菌土壤、生长介质和营养繁殖材料传播。在2007年被列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。针对P.splendens的检测已有特异性引物［5］、PCR－RFLP［6］、核糖体DNA序列分析［4］等方法。随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR以其具有的高特异性、高灵敏度以及快速的优点越来越多地应用于疫病的检测。

真核生物核糖体 DNA（rDNA）由18S、ITS1（internal transcribed space）、5.8S、ITS2 和 28S构成，头尾串联形成重复序列，一个基因组内有60～200个拷贝。ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SrDNA基因也被包括在ITS之内。rDNA上5.8S、18S和28SrDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究［7］。本研究通过对病原菌及相关种的rDNA ITS序列进行比较分析，设计了针对P.splendens的引物和探针，建立了P.splendens实时荧光PCR检测方法，为口岸检验检疫提供快速、准确的检测技术。