游荷花，沈敬华

（1.山西医科大学 汾阳学院，山西 汾阳032200；2.内蒙古医学院，内蒙古 呼和浩特010000）

Myo5a，染色体定位：15q21，是肌球蛋白重链12条（MYH12）。它是一种“摩托蛋白”，在细胞内物质运输中发挥重要作用，属于肌球蛋白家族中MyosinV中的一员，是依赖微丝运动参与细胞内物质运输的。Myo5a是此家族中新发现的成员，为肌球蛋白提供了新的研究方向。最近的研究发现Myo5a可能与一些肿瘤的发生有关［1］。为进一步研究Myo5a与肿瘤的发生有无相关性，本研究构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX－4T－3／Myo5a，并进行了鉴定，以期为后续研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

Myo5aDNA模板，原核表达载体PGEX－4T－3，大肠杆菌菌株DH5α均来自本实验室。BamHⅠ、XhoⅠ等DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶均由Takara公司提供。质粒小量提取试剂盒，胶回收试剂盒均由AXYGEN公司提供。

1.2 设计引物并合成

根据GenBank的人类Myo5a基因全序列，设计合成一对引物来扩增Myo5a羧基端第5077－5208碱基对长131bp的小片断。在上游引物PF的5′端添加BamHⅠ识别序列和保护序列，在下游引物PR的5′端添加XhoⅠ识别序列和保护序列。引物序列如下：

PF／BamH Ⅰ 5′－CG／GGATCC／ATGTTCTACATCATAGGG－3′

PR／XhoⅠ5′－CCG／CTCGAG／CAGATTCTTGTCACGCAG－3′

1.3 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Myo5a特异性小片断

在冰上将0.5μL的Myo5aDNA模板，2μL的引物，1μL的dNTP，0.5μL的 DNA 聚合酶（Vent酶），5μL的缓冲液，41μL的DI H20构成50μL体系加入PCR管中。先95℃预变性2 min。然后95℃变性15s，50℃退火30s，72℃延伸45s，此三步循环30次。然后4℃保温。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。得到所需扩增片段后使用RCR纯化试剂盒提纯DNA。

1.4 克隆目的基因

将上述PCR产物、质粒载体PGEX－4T－3分别进行BamH I和X ho I双酶切，酶切后的产物经胶回收试剂盒纯化；之后利用T4DNA连接酶在4℃过夜条件下将Myo5a基因小片段与质粒载体PGEX－4T－3按一定比例相连接。……