蓝国兵， 谭耀华， 何自福＊， 罗方芳， 梁丽欢， 虞 皓

（1.广东省农业科学院植物保护研究所，广州 510640；2.广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；3.高要市农业技术推广中心，广东 526100）

黄瓜褐斑病（Corynesporacassiicola）在广东首次报道

蓝国兵1，2， 谭耀华3， 何自福1，2＊， 罗方芳1， 梁丽欢3， 虞 皓1

（1.广东省农业科学院植物保护研究所，广州 510640；2.广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；3.高要市农业技术推广中心，广东 526100）

2011年5月和8月，在广东省高要市和增城市黄瓜主产区发现黄瓜褐斑病，致病性测定、形态学观察和rDNA－ITS序列分析结果表明，引起广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）。本文是多主棒孢霉在广东引起黄瓜褐斑病的首次报道。

黄瓜褐斑病； 多主棒孢霉； 病原鉴定

致 谢： 本实验室杜振国博士和汤亚飞助理研究员在分子鉴定方面给予了热心指导，增城市果树蔬菜研究所肖旭林农艺师在标本采集过程中给予了热情帮助，特此致谢。

＊ 通信作者Tel：020－87597476；E－mail：hezf＠gdppri.com

多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）侵染引起的褐斑病是黄瓜（CucumissativusLinn.）生产上重要病害之一。目前，该病已在我国辽宁［1－2］、河南［3］、河北［4］、山东［5］、宁夏［6］、甘肃［7］和上海［8］等省市的露地及保护地黄瓜上较普遍发生，并造成严重损失。除黄瓜外，该病原菌还能侵染茄子［9］、番茄［10］、苦瓜［11］、烟草［12］、橡胶［13］和木薯［14］等经济作物。多主棒孢霉主要侵染寄主植物的叶片，造成叶斑症状，严重时会造成落叶、落果等现象。

2011年5月，首次在广东省高要市黄瓜产区发现疑似黄瓜褐斑病，生长中后期的黄瓜植株受害最为严重，田间病株率20%～50%，甚至100%。同年8月，在广东省增城市黄瓜产区也发现该病害，但零星发生，危害也较轻。为了弄清该病害的病原，进而指导农民科学防治，作者对发生在广东的疑似黄瓜褐斑病的病原进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离和纯化

2011年5月和8月，分别在广东省高要市和增城市黄瓜产区采集疑似黄瓜褐斑病症状的病叶，采用植物病原真菌病组织常规分离法［15］进行病原菌分离。分离的菌株单孢纯化后，保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中保存备用。

1.2 致病性测定

选取高要和增城的代表性菌株各1株（编号分别为GY1和ZC1），分别接种于PDA平板上，28℃培养10d后用无菌水洗下分生孢子，并配成浓度为1×105个／mL的孢子悬浮液。用手持喷雾器将孢子悬浮液接种2片真叶期的黄瓜幼苗叶片（品种：‘丰研6号’，山西省夏县良丰蔬菜研究所），以叶面布满小水珠但不下滴为宜，接种清水作为空白对照。黑暗保湿培养24h后，置于28℃温室中培养，接种4d后观察发病情况，并对接种病叶组织进行病原菌再分离。试验重复3次，每次接种10株黄瓜苗。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态学观察

将分离的病原菌株接于PDA平板上，28℃恒温培养5～15d，不定期观察菌株的菌落形态、产孢结构和分生孢子形态等特征，并测量分生孢子的大小，参照相关的文献报道［2，8－16］，鉴定病原菌。

1.3.2 病原菌rDNA－ITS序列分析

将代表菌株GY1和ZC1接于PDA平板上，28℃恒温培养10d后，参考刘丹等报道的CTAB法［17］提取病原菌基因组DNA。以真菌通用引物ITS4和ITS5［18］进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）包括 DNA 模板2μL（20～30ng），引物ITS4（10μmol／L）和ITS5（10μmol／L）各2μL，Premix Ex Taq® Version 2.0 25μL（TaKaRa公司），ddH2O 19μL。PCR扩增程序：95℃预变性6min，94℃变性30s，55 ℃退火30s，72℃延伸50s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。在1%琼脂糖凝胶上检测PCR结果，回收PCR产物，送上海英骏生物技术有限公司测序，将所得ITS序列登录到GenBank，并进行Blast同源性比对。

2 结果与分析

2.1 黄瓜病株田间症状

广东省高要市蚬岗镇露地栽培黄瓜（品种为‘丰研6号’，山西省夏县良丰蔬菜研究所）病株症状表现为：叶片先出现水浸状黄色小点，略凹陷，对光可见小点透明；病斑进一步扩展为近圆形，多数病斑受叶脉限制呈不规则形或多角形；后期病叶布满黄色或黄褐色病斑，像一个“靶子”（图1）。病株中下部叶片先发病，逐渐向上部叶片发展。田间有时与黄瓜霜霉病混合发生。

图1 广东黄瓜褐斑病田间症状

2.2 病原菌致病性测定结果

从高要市和增城市的黄瓜病叶中分别分离到6株和3株病原真菌，这些菌株菌落形态基本一致。从高要和增城分离的菌株中各选取1株作为代表菌株（编号分别为GY1和ZC1）进行致病性测定，结果显示，28℃喷雾接种4d后，2个菌株均可导致黄瓜叶片正面上出现水浸状圆形黄色小病斑，叶片背部呈现灰白色小病斑（图2）；后期病斑逐步扩展，呈现圆形或多角形，与田间病叶症状相似，而清水接种的叶片没有发病症状。从这些接种发病叶中重新分离到与接种菌株相同的病原菌。

2.3 病原菌形态学鉴定结果

在PDA平板上，菌落平展，灰色至浅棕色，培养基表面形成毡毛状的菌丝层，后期菌株分泌黄褐色色素。分生孢子梗由菌丝衍化而来，无子座。分生孢子呈浅褐色，常单生，或2～5个串生于顶端，直立或稍弯，圆柱形或倒棍棒形，基部平截，顶部钝圆，半透明至浅褐色，有2～8个假隔膜，大小（25～150）μm×（4～9）μm（图3）。各菌株的形态表现基本一致。这些特征与文献［2，8－16］报道的黄瓜褐斑病菌基本一致，将引起广东黄瓜褐斑病的病原菌初步鉴定为多主棒孢霉（C.cassiicola）。

2.4 病原菌rDNA－ITS序列分析结果

应用真菌18S－28SrDNA间隔区序列（ITS）的通用引物ITS4和ITS5，从菌株GY1和ZC1的DNA中分别PCR扩增到580bp左右的特异片段。序列测定结果显示，2个特异片段长均为583bp，且两者序列完全一致。BLAST比对结果表明，菌株GY1（GenBank登录号：JQ595296）、ZC1（GenBank登录号：JQ595297）与C.cassiicola菌株（AY238606和AY238605）的ITS序列同源性为100%，与C.cassiicola其他菌株（JN54124、GU461298、GU138988、FJ85275）的序列同源性达99.8%（仅1个碱基差异）。该结果进一步支持广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉（C.cassiicola）。

3 结论与讨论

应用常规的植物病原真菌研究方法，从广东黄瓜褐斑病样组织中成功分离获得病原菌，形态学鉴定显示，该病原菌为多主棒孢霉（C.cassiicola），rDNA－ITS序列分析进一步支持该鉴定结果。因此，本研究将侵染引起广东黄瓜褐斑病的病原菌鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色菌科、棒孢属（Corynespora）的多主棒孢霉（C.cassiicola）。

在国内，由多主棒孢霉侵染引起的黄瓜叶斑症状的病害，不同研究者给以不同名称，分别为黄瓜褐斑病［1－3，7，16］、黄瓜靶斑病［6，8］和黄瓜棒孢叶斑病［4］3种，但目前称之为黄瓜褐斑病的占多数。因此，本研究中，我们也选用黄瓜褐斑病这个名称。

早在上世纪五六十年代，我国已有多主棒孢霉侵染黄瓜的文献报道［19］。上世纪90年代初，多主棒孢霉引起的黄瓜褐斑病在辽宁保护地大面积发生［1］。随后的20年时间里，该病害不断扩展，危害也日趋严重，但主要集中在我国北部及西北部省份，且主要发生在设施栽培的黄瓜上［8］。在广东黄瓜产区，一直未见多主棒孢霉侵染引起的黄瓜褐斑病发生与危害报道。因此，该病害是广东黄瓜上发生的一种新病害。

邹庆道等［2］的研究表明，黄瓜褐斑病菌（C.cassiicola）的菌丝生长最适温度为28℃，产孢最适温度为30℃；在有水滴条件下，孢子在15～35℃范围内均能萌发，说明该病菌具有喜温好湿的特点。广东常年高温、高湿，气候条件十分利于该病的发生与流行，近期的调查发现，在粤西湛江和茂名部分黄瓜产区也发生了该病害（结果未显示），这说明该病害正在广东省扩展蔓延，应加强监测与防治研究。

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First report ofCucumissativusbrown spot disease infected byCorynesporacassiicolain Guangdong Province

Lan Guobing1，2， Tan Yaohua3， He Zifu1，2， Luo Fangfang1， Liang Lihuan3， Yu Hao1
（1.ResearchInstituteofPlantProtection，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection，Guangzhou510640，China；3.GaoyaoAgriculturalTechnologyExtensionCenter，Guangdong526100，China）

Cucumber brown spot disease was observed in Gaoyao and Zengcheng of Guangdong Province in May and August，2011，respectively.The results of pathogenicity test，morphological observation and rDNA－ITS sequence comparison indicated that cucumber brown spot was caused byCorynesporacassiicolain Guangdong Province.This paper was the first report of the disease in Guangdong Province，China.

cucumber brown spot disease；Corynesporacassiicola； pathogen identification

S 436.21

B

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.043

2012－01－07

2012－02－03

国际科技合作项目（2011DFB30040）；星火计划重点项目（2011GA780007）；广东省科技计划项目（2009A020101001；2009B020201004；2010B050300014）；广东省现代农业产业技术体系创新团队专项