回振龙，马 兰，李朝周

（1．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州730070）

多花黑麦草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麦草、一年生黑麦草，是具世界栽培意义的禾本科牧草，其具有生长速度快、产量高、适应性强、适口性好和营养价值丰富等优点［1－2］。而中国现正面临着酸雨污染面积扩大、酸雨酸度增大、频次增多、污染严重的困扰，这对多花黑麦草的栽培及生长发育造成严重的影响［3－4］。钴是许多植物和微生物必需的微量元素之一。植物一般含有0．05～0．50 mg·L－1的钴，豆科植物含量较高，禾本科植物含量较低［5］。反刍动物瘤胃微生物合成维生素B12也需要钴的参与［6］，所以在畜牧业生产中要给畜禽补饲一定数量的钴盐，最好的方式是大面积草地小剂量喷洒［7］。而关于施钴对酸胁迫下植物种子的萌发及幼苗生长状况的影响还鲜见报道。本研究就CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草种子的萌发及幼苗生理特性的影响进行探讨，旨在进一步认识钴在植物逆境生理生态中的作用，为中国酸雨多发区多花黑麦草的生产及畜牧业的发展提供理论支持。

1 材料与方法

1．1 试验材料 试验所用多花黑麦草种子由甘肃省农业科学院果树研究所提供。

1．2 酸溶液的配制 本试验酸溶液由分析纯浓硫酸（98%）和蒸馏水混合而成。将硫酸配制成pH值为1．0的母液，用上海雷磁仪器厂生产的pH－29A型数显酸度计测定并配制出pH值分别为3．0、4．0、5．0和5．8（蒸馏水）的酸溶液。

1．3 测定指标与方法

1．3．1 预处理 试验前将种子用1%的次氯酸钠溶液浸种30min消毒，然后用清水反复冲洗后备用。

1．3．2 CoCl2溶液浸种对多花黑麦草种子萌发的影响 在50mL三角瓶中分别加入不同浓度（0、0．000 5、0．002、0．01、0．1、1．0和10mmol·L－1）的CoCl2溶液各25mL。按国家种子质量检验标准［8］随机抽取预处理多花黑麦草种子各300粒放入盛有不同浓度CoCl2溶液的三角瓶中，置于培养箱内暗中浸泡24h（20±2℃）。次日将盛有不同浓度CoCl2溶液浸种的多花黑麦草种子吸干表面水分后整齐摆放于铺有两层滤纸的培养皿内，每个培养皿中各放100粒（培养皿事先在120℃烘箱内放置4h后冷却至室温），每个处理水平重复3次，放入培养箱中（20±2℃）进行催芽。每天补充等体积蒸馏水以确保培养环境的湿润。发芽以胚根长度达到种子自身长度为标准［9］，每天统计发芽的种子数。计算发芽率（8d，测试种子发芽数占测试种子总数的百分比）、发芽势（4d，发芽过程中日发芽种子数达到最高峰时发芽的种子数占供测样品种子数的百分率［10－11］）和根长抑制指数（正常情况下的根长减去经处理后根长的差与正常根长的比值的百分数［12］）。

1．3．3 CoCl2对酸溶液胁迫下多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响 根据CoCl2溶液浸种对多花黑麦草种子萌发试验的结果分别选取0．01和0．1 mmol·L－1的CoCl2溶液浸种24h后的多花黑麦草种子50粒，整齐摆放于铺有两层滤纸的培养皿内，每个培养皿中分别加入pH 值为3．0、4．0、5．0、5．8的酸溶液5mL，每个处理水平重复3次。将放有种子并加入酸溶液或蒸馏水的培养皿放入光照培养箱中（20±2℃）进行催芽。每天更换等体积相应的酸溶液以确保酸溶液的pH值不变。计算发芽率（8d）、发芽势（4d）［10－11］、根长抑制指数［12］。于第10天对幼苗进行各项抗性生理指标的测定。

1．3．4 抗性生理指标的测定

叶绿素含量：采用丙酮显色法［13］。用722N型分光光度计测定663、646和470nm波长下的光密度值。

丙二醛（MDA）含量：采用硫代巴比妥酸（TBA）法［13］。

超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用分光光度法，以抑制氮蓝四唑（NBT）光氧化还原一半的酶量定义为一个酶活力单位［14］。

过氧化物酶（POD）活性：采用愈创木酚比色法，以每分钟光密度变化值表示酶活性的大小［14］。

细胞膜稳定指数（MSI）：参照Sairam 等［15］的方法。

O－2·的产生速率：参照王爱国和罗广华［16］的方法，测定环境中的光照强度为120μmol·m－2·s－1。

H2O2含量：参照林植芳等［17］的方法。

1．4 数据处理 各项试验重复3～5次，数据采用Excel软件和SPSS统计分析软件进行分析，取P＜0．05为显著相关。

2 结果与分析

2．1 CoCl2溶液浸种及酸胁迫对多花黑麦草种子萌发的影响 除10．0mmol·L－1CoCl2溶液浸种处理显著抑制种子萌发外，其他浓度CoCl2溶液浸种均不同程度地促进了多花黑麦草种子的萌发（表1）。当CoCl2浓度为0．01mmol·L－1时，发芽率最高，比对照增加了11．09%。

CoCl2溶液对多花黑麦草根的抑制强度随着浓度的增加而增强，10．0mmol·L－1处理根长抑制指数为44．13%（表1），且根尖发黑。

CoCl2对酸胁迫下多花黑麦草种子萌发的影响因CoCl2溶液浓度和酸溶液酸度而异（表2）。适宜浓度CoCl2处理对酸胁迫下多花黑麦草种子的萌发有促进作用，尤以0．1mmol·L－1CoCl2的促进作用较明显。

表1 CoCl2溶液浸种对多花黑麦草种子萌发的影响Table 1 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorum

表2 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草种子萌发的影响Table 2 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorumunder acid stress

从根长抑制指数的变化趋势来看，酸溶液胁迫抑制多花黑麦草种子的生根，酸溶液酸度越大抑制作用越强（表2）。

2．2 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草幼苗生长发育的影响 酸胁迫时，0．01和0．1 mmol·L－1CoCl2对多花黑麦草芽长和地上部干质量均有一定的促进作用，且0．1mmol·L－1CoCl2的促进作用较为显著（图1）。

2．3 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草幼苗抗性生理的影响

2．3．1 叶绿素含量、MDA含量和 MSI CoCl2溶液浸种处理在一定程度上提高了多花黑麦草幼苗的叶绿素含量。0．1mmol·L－1CoCl2溶液对酸胁迫下幼苗叶绿素的降解具有一定的保护作用（图2）。

0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可在一定程度上减少MDA含量的增加，说明0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可减少酸胁迫下幼苗脂质过氧化产物的累积（图2）。

多花黑麦草幼苗MSI随着酸溶液强度的增加而下降。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2溶液处理幼苗MSI均显著高于相同酸度对照处理（图2）。

2．3．2 超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性 酸胁迫下多花黑麦草幼苗SOD活性随着酸溶液酸度的增加而降低。CoCl2浓度为0．1mmol·L－1时幼苗SOD活性升高最明显（图3）。

酸胁迫下多花黑麦草幼苗POD活性随着酸溶液酸性增强先升高后降低。CoCl2浓度为0．1 mmol·L－1时对酸胁迫下多花黑麦草幼苗POD活性增强的抑制作用最显著（图3）。

2．3．3 O－2·产生速率和H2O2含量 多花黑麦草幼苗O－2·产生速率和H2O2含量随着酸溶液酸性的增加逐渐增大（图4）。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2处理抑制了酸胁迫对幼苗脂质过氧化的作用，且酸性越强其作用越明显。

3 讨论与结论

一般认为钴并非植物必需的微量元素，就钴是否为所有高等植物所必需尚未形成定论，但它对一些植物有积极的作用已被确定［18－19］，具体表现在适宜浓度范围的钴对植物种子萌发、幼苗生长具有一定的促进作用［20］；能显著提高小麦（Triticum aestivum）籽粒和秸秆的产量［21］；刺激植物生长，稳定叶绿体［22］；对氨基酸、辅酶、蛋白质的代谢也有影响［23］。此外，钴对植物逆境生理也表现出了一定的作用，如适量的钴对干旱胁迫下大豆（Glycine max）幼苗叶片有一定的保护作用［24］，能够提高干旱胁迫下紫花苜蓿（Medicago sativa）种子的萌发及幼苗的生长［25］。它也是参与和构造维生素B12特定结构的元素［26］，参与植物体呼吸作用和能量代谢，稳定叶绿素结构［27］，而且钴表现有促进生长素和细胞分裂素形成及抑制乙烯产生的作用［19］。上述研究说明，钴在植物生长发育及抗逆生理等方面具有一定的作用，但有关钴对农作物或牧草品质和产量的影响并未取得一致的结果，这可能与供试土壤、钴的使用浓度和作物类型及环境条件有很大的关系［19］。

图1 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草芽长、地上干质量和地下干质量的影响Fig．1 Influences of CoCl2on shoot length，shoot dry weight and root dry weight of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

酸胁迫下钴对牧草生长发育及抗逆生理的影响尚缺乏研究报道。本研究结果表明，CoCl2溶液浸种对多花黑麦草芽长和地上部干质量均有一定的促进作用，提高了多花黑麦草幼苗的叶绿素含量和细胞膜稳定指数，在一定程度上减少丙二醛含量的增加，增强了超氧化物歧化酶的活性，对过氧化物酶活性的增强有明显的抑制作用，并减缓了酸胁迫对幼苗脂质过氧化的伤害。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2都能较为有效的保护幼苗，减轻酸胁迫的伤害，但这种保护机制同时受到酸液酸度的影响，0．1 mmol·L－1CoCl2对酸溶液胁迫下多花黑麦草种子萌发及幼苗生长发育的保护作用最明显。施用CoCl2可增强多花黑麦草幼苗的抗酸能力，缓解酸胁迫造成的伤害，其原因可能与钴的生理功能有关，即钴是乙烯合成重要酶——1－氨基环丙烷－1－羧酸氧化酶的抑制剂，通过抑制该酶的活性，钴元素可显著抑制乙烯的产生［28］。而乙烯作为植物体内具有多种生理功能的重要激素之一，在植物细胞遭受较为严重的伤害时，乙烯与活性氧可以相互促进对方的合成［29］。由此，通过抑制乙烯产生，钴元素可能对酸胁迫下细胞膜的伤害起到一定的减缓作用。

图2 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草幼苗叶绿素含量、丙二醛含量和细胞膜稳定指数的影响Fig．2 Influences of CoCl2on chlorophyll，malondialdehyde content and membrance stablility index（MSI）of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

图3 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草幼苗超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响Fig．3 Influences of CoCl2on activities of SOD and POD of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

图4 CoCl2溶液浸种对酸胁迫下多花黑麦草幼苗超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的影响Fig．4 Influences of CoCl2on production rate of O－2·and H2O2content of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

［1］ 张新跃，李元华，苟文龙，等．多花黑麦草研究进展［J］．草业科学，2009，26（1）：55－60．

［2］ 赵超鹏，周琴，曹春信，等．多效唑对多花黑麦草物质积累和种子产量的影响［J］．草业科学，2010，27（3）：72－75．

［3］ 王润元，姚桃峰，王鹤龄，等．孕穗期模拟酸雨对春小麦叶片光合气体交换特性及产量的影响［J］．草业学报，2011，20（1）：237－241．

［4］ 许能祥，顾洪如，程云辉，等．不同多花黑麦草品种萌发期耐 盐 性 评 价 ［J］．草 业 科 学，2011，28（10）：1820－1824．

［5］ 王忠．植物生理学［M］．第一版．北京：中国农业出版社，2000：90．

［6］ 王润莲，张微，张玉枝，等．不同钴源对肉用绵羊维生素B12合成及瘤胃发酵的影响［J］．动物营养学报，2007，19（5）：534－538．

［7］ 王桂芹，王淑萍，吴丽芳，等．钴在牧草和饲料生产中的作用［J］．饲料研究，1999（6）：32－33．

［8］ 国家技术监督局．GB／T 3543．1－3543．7－1995农作物种子检验规程［S］．北京：中国标准出版社，1995．

［9］ 颜启传．种子学［M］．北京：中国农业出版社，2001：420－433．

［10］ 李焰焰，聂传朋．酸溶液对小黑麦种子萌发及幼苗生理特性的影响［J］．生态学杂志，2005（4）：395－397．

［11］ 郑蔚虹，冷建梅．青霉素、过氧化氢和高锰酸钾浸种对沙棘种子萌发及幼苗生长的影响［J］．种子，2003，2（6）：21－22，29．

［12］ Kang H，Lee W S．Responses of maternal siblings of Pinus densiflora to simulates acid rain［J］．Plant Biology，2001，44（3）：31－140．

［13］ 邹琦．植物生理实验指导［M］．北京：中国农业出版社，2004：72－75，173－174．

［14］ 郝再彬，苍晶，徐仲，等．植物生理实验［M］．哈尔滨：哈尔滨大学出版社，2004：101－108，115－116．

［15］ Sairam R K，Siiukla D S，Saxena D C，et al．Stress induced injury and antioxidant enzymes in relation to drought tolerance in wheat genotypes［J］．Blologia plantarum，1998，40（3）：357－364．

［16］ 王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的定量关系［J］．植物生理通讯，1990（6）：55－57．

［17］ 林植芳，李双顺，林桂珠，等．衰老叶片和叶绿体中H2O2的累积与膜脂过氧化的关系［J］．植物生理学报，1988，14（1）：16－22．

［18］ Aery A C，Jagetiya B L．Effect of cobalt treatments on dry matter production of wheat and DTPA extractable cobalt content in soils［J］．Communications in Soil Science and Plant Analysis，2002，31：9－10．

［19］ 陆宇．豆科与禾本科牧草对土壤钴水平的形态与生理响应［D］．北京：中国农业科学院，2008：1－7．

［20］ Hewitt E J．Effect of mineral deficiencies and excesses on growth and composition［A］．In：Bould C．Diagnosis of Mineral Disorders in Plants［M］．London：Prinipals，1983：54－110．

［21］ 樊文华，杨黎芳，薛晓光，等．施钴对冬小麦产量和蛋白质含量及土壤有效钴含量的影响［J］．土壤通报，2005，36（1）：92－95．

［22］ 刘素萍，樊文华．钴对番茄生长发育影响的初步研究［J］．土壤通报，2005，36（6）：925－928．

［23］ 陶新，汪以真．钴在动物营养中的研究进展［J］．饲料世界，2002（1）：4－6．

［24］ 焦健，李朝周，黄高宝．钴对干旱胁迫下大豆幼苗叶片的保护作用及机理［J］．应用生态学报，2006，17（5）：796－800．

［25］ 张振明，余新晓，焦健，等．干旱胁迫下CoCl2对紫花苜蓿种子萌发及幼苗生长的影响［J］．种子，2005，24（5）：1－4．

［26］ 牛莲珍．人和动物的微量元素营养［M］．青岛：青岛出版社，1994：28－35．

［27］ 邹邦基．植物营养［M］．北京：农业出版社，1985：303－309．

［28］ 李朝周．CoCl2对Na2CO3胁迫下苜蓿幼苗叶片细胞膜的保护作用［J］．草业学报，2007，16（3）：49－54．

［29］ 焦健，李朝周，黄高宝．乙烯产生抑制剂对高温胁迫下蚕豆幼苗叶片的保护作用［J］．植物生态学报，2006（3）：465－471．