周奇志，魏焦禄，蔡定均△，彭晓华，余曙光，郑 重，方杨琪

（1.成都中医药大学针灸推拿学院针灸学实验室 610075；2.四川大学华西医院心理卫生中心电生理室，成都 610041；3.成都中医药大学附属医院针灸学校 610041）

研究显示，焦虑障碍总体年发病率和终身患病率分别是10.6%和16.6%［1］；且治疗成本高，干预措施的有效性与高成本并非成正比［2］。中枢特别是海马、前额皮质等边缘结构分布有大量的肾上腺皮质激素受体［盐皮质激素受体（MR）和糖皮质激素受体GR）］，MR和GR均可与糖皮质激素结合，共同调节应激、焦虑情绪等，且MR／GR系统的失平衡可导致焦虑情绪的发生。电针、重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）治疗焦虑障碍均显示一定疗效［3－4］，但总体疗效还不够突出，尚缺乏二者结合的效应和机制研究。本课题拟探索电针结合rTMS抗焦虑协同效应的部分中枢作用机制，为临床寻求经济、有效和安全的治疗措施，提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 RAPID2型rTMS器，英国 Magstim公司生产；PM－200十字迷宫视频跟踪系统，成都泰盟公司生产；基因扩增仪（C1000，BIO－RAD）；荧光定量 PCR（CFX96，BIO－RAD）。总RNA提取试剂盒（离心柱型）、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒和Quant一步法逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）试剂盒购自北京TIANGEN生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型复制 （1）实验条件:选用清洁级雄性SD大鼠50只，体质量180～220g，购自成都中医药大学动物实验中心［合格证书号:川实动管质第SCXK（川）2009－11］；（2）分组:将50只大鼠随机分为空白组、模型组、模针组、模磁组、磁针组，每组10只；（3）动物在实验前适应性驯养1周。参考单个持续刺激（single prolonged stress，SPS）方法［5］，复制焦虑模型，即禁锢2h，强迫性游水20min，乙谜麻醉至意识丧失后，立即放回原笼，单笼饲养。

1.2.2 实验方法 空白组:每天在相同的时间进行与模针组相同的方法固定。模型组:在造模后次日，处理方法同空白组。模针组:在造模后次日进行电针治疗。穴位选择:“百会”、“长强”，依据《实验针灸学》的动物穴位图谱模拟定位［6］。接电针治疗仪，选用疏密波，频率15～25次／分。每天1次，持续15 min，连续治疗3d。模磁组:在造模后次日，对大鼠头部进行rTMS治疗。运动阈值（motor threshold，MT）为75% ，刺激频率18.3Hz，400个脉冲。每天1次，连续治疗3d。磁针组:在造模后次日，对大鼠先后进行电针和rTMS治疗，方法同模针组和模磁组。

1.2.3 指标检测方法 （1）行为学检测:在治疗结束后次日，按文献［7－8］分别进行旷场实验（open field，OF）和高架十字迷宫实验（elevated plus maze，EPM）。（2）脑组织和血清采集:实验结束后，采用乙醚轻度麻醉各组动物，断头迅速取脑，置于液氮冷冻待测。参照脑立体定位图谱［9］，取海马和前额皮质组织块约20mg，进行组织匀浆。（3）MR和GR基因表达指标测试:按照相关试剂盒说明书，运用一步法RT－PCR测试基因表达。MR mRNA上游引物3′－AAC AAA ATG CCC CAC GGT TA－5′（20bp），下游引物3′－GGG ACG ATG CAA TGG ACT GT－5′（20bp）。GR mRNA上游引物3′－GGA TTT CCA GAG CCC ACC AT－5′（20bp），其下游引物3′－CAT TCC TGA TGG TCA CCT CG－5′（20bp）。

2 结 果

2.1 行为学实验 旷场实验结果:与空白组相比，模型组大鼠垂直运动次数明显减少（P＜0.05）；与模型组相比，模磁组、磁针组水平移动格数、垂直运动次数显著增加（P＜0.01），模针组垂直运动次数显著增加（P＜0.01）；而磁针组较模针组、模磁组水平移动格数、垂直运动次数均显著增加（P＜0.05）。十字迷宫实验结果:与空白组比较，模型组大鼠OT%值、OE%值明显下降（P＜0.01）；与模型组相比，治疗3组OT%值、OE%值均显著增加（P＜0.05）。结果见表1。

表1 行为学实验各组指标比较（，n＝10）

表1 行为学实验各组指标比较（，n＝10）

▲:P＜0.05，与空白组比较；★:P＜0.05，与模型组比较；■:P＜0.05，与磁针组比较。

组别旷场实验水平移动格数 垂直运动次数十字迷宫实验OT% OE%空白组 110.67±13.3518.45±4.32 0.36±0.12 0.46±0.19模型组 99.33±21.6212.67±3.78▲ 0.11±0.06▲ 0.13±0.12▲模针组 107.56±15.48■ 19.56±3.97★■ 0.31±0.14★ 0.32±0.11★模磁组121.00±13.65★■ 23.29±3.35★■ 0.30±0.12★ 0.29±0.06★磁针组 138.25±12.16★ 30.00±6.76★ 0.29±0.14★ 0.31±0.14★

析因设计的方差分析结果显示，对行为学效应指标（OT%、OE%、水平移动格数和垂直运动次数）电针治疗的统计量F值分别为6.500、8.594、5.154和15.073，P 值分别为0.015、0.006、0.031和0.001，rTMS 4个指标统计量F 值分别为4.617、5.043、21.778和36.140，P 值分别为0.038、0.031、0.000和0.000，可认为两种治疗单独用有统计学意义，与表1结果基本一致。电针与rTMS同用时交互作用只在OT%、OE%两指标上差异有统计学意义（F值分别为7.657和5.478，P值分别为0.009和0.025），表明在十字迷宫实验中电针、rTMS同时运用显现抗焦虑协同效应。

2.2 各组大鼠海马、前额皮质MR和GR基因表达变化 大鼠经SPS造模后，（1）模型组海马GR mRNA的CT值、MR mRNA／GR mRNA的CT值比值均较空白组升高（P＜0.05）；而模针组和磁针组GR mRNA的CT值较模型组均有下降（P＜0.05）；MR mRNA各组差异不明显（P＞0.05）。结果见表2。（2）模型组前额皮质 MR mRNA和GR mRNA的CT值以及比值与空白组、治疗组比较差异不明显（P＞0.05）。

由于CT值与起始模板拷贝数成反比，CT值越大，起始模板拷贝数越少，表示基因表达量越少。因此结果提示，造模后模型动物海马GR基因表达量、MR mRNA／GR mRNA明显低于正常动物，治疗各组均显示一定程度改善，且电针和电针结合rTMS对海马GR基因表达量影响显著。

表2 各组大鼠海马MR和GR的mRNA CT值及其比值的比较（，n＝10）

表2 各组大鼠海马MR和GR的mRNA CT值及其比值的比较（，n＝10）

▲:P＜0.05，与空白组比较；★:P＜0.05，与模型组比较。

组别 MRmRNA GR mRNA MR mRNA／GR mRNA空白组18.72±1.5916.93±2.26 1.12±0.18模型组 17.92±1.38 18.94±2.42▲ 0.96±0.11▲模针组 17.82±2.3916.89±2.18★ 1.07±0.20模磁组 17.18±2.4617.08±2.32 1.03±0.26磁针组 17.43±2.1916.76±1.45★1.04±0.13

3 讨 论

焦虑障碍（anxiety disorder）是包括广泛性焦虑障碍、恐惧症、惊恐发作、创伤后应激障碍以及强迫症等在内的一组临床障碍［10］。经过半个多世纪各国学者的大量研究，已相继成功建立了各种各样的焦虑动物模型和检测方法。目前较多以SPS方法复制创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder，PTSD）大鼠焦虑模型［5，7，11－12］。OF和 EPM 两项实验已成为国际公认有效评价动物焦虑情绪行为的常用测试方法［7－8］。本研究选用SPS方法，且单笼饲养，造成动物躯体和心理应激刺激，模型动物与正常比较有明显的焦虑样反应，说明该焦虑模型塑造成功。本研究结果显示，电针、rTMS均有改善焦虑情绪反应的作用，这与文献报道有一致性［3－4，13］。电针结合rTMS抗焦虑协同效应的研究虽未见报道，但本研究结果显示电针结合rTMS治疗焦虑抑郁具有协同效应［14］。

目前关于电针结合rTMS抗焦虑机制研究尚缺乏。近年来研究表明MR／GR系统对焦虑、恐惧情绪反应等起重要作用。研究显示，运用SPS造模大鼠，24h急性应激后海马GR和MR的mRNA均降低，可致 MR／GR比值下降，7、14d后GR升高、MR仍下降，MR／GR比值降低［12］。在社会孤立应激模型（单笼饲养）研究中，应激1周后在海马和丘脑GR结合率降低、顶叶皮质和垂体未见变化，MR水平也未见变化；3周后在海马和丘脑下降的GR回复至正常水平，而顶叶皮质GR结合率却下降，海马和中隔组织的MR水平严重低下，提示社会应激刺激导致皮质激素受体持续下调以及不同脑区不同阶段GR和MR有不同变化［15］。本项研究结果显示，造模后5d动物海马GR基因表达量、MR mRNA／GR mRNA比值均发生了明显改变，即显著低于正常水平，而海马 MR及前额皮质GR和MR mRNA表达水平均未现变化，这与文献报道有一定相似性。本研究3种治疗对模型动物海马GR mRNA表达量均有一定程度改善，且电针和电针结合rTMS影响明显。结合本研究结果，电针结合rTMS具有抗焦虑协同效应，其机制可能主要与改变海马GR基因表达有关。

综上所述，本研究初步揭示电针结合rTMS具有抗焦虑协同效应，其作用可能与调节肾上腺皮质激素受体基因表达相关，而基因表达改变后其下游分子事件是否参与了电针结合rTMS协同抗焦虑作用，尚待进一步探究。

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