陈青，陈晓，孙俊，曾容，胡素泉，李岷，刘维达

香菇多糖（lentinan，LNT）作为免疫调节剂已在我国、日本、美国及东南亚各国等临床上用于肿瘤治疗，该多糖是菌体细胞壁中分离的主链为1→3 连接键型、枝链为 1→6 键型的 β-D-葡聚糖[1-3]。国外学者及我们的研究均表明树突状细胞相关 C 型凝集素 1（Dectin-1）是识别 β-葡聚糖、激活免疫反应的最主要模式识别受体[4-6]。本研究旨在研究香菇多糖能否依赖人单核/巨噬细胞系THP-1 细胞表达的 Dectin-1 介导来诱导产生IL-12。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及主要试剂 香菇多糖购自南京康海药业有限公司；人 THP-1 细胞株购自美国模式菌种收藏中心（ATCC）；IL-12 酶联免疫吸附试剂盒购自美国 R&D Systems 公司；SuperScript III 逆转录酶试剂盒为美国 Invitrogen 公司产品；Dectin-1抑制剂昆布多糖（laminarin）为美国 Sigma 公司产品。

1.1.2 仪器 Smart Cycler System II 型实时荧光定量 PCR 仪为美国 Cepheid 公司产品；Bio-rad 680 型全自动酶标仪为美国 Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人 THP-1 单核细胞在含 10%小牛血清、1% 青链霉素的 RPMI 1640培养基中，于 37 ℃、5% CO2环境下培养、传代。接种 2 × 106个细胞于 6 孔培养板，血清饥饿 16 h 后，与刺激物共培养。

1.2.2 实时荧光 RT-PCR THP-1 细胞与 LNT（终浓度 5 μg/ml）共培养，并设培养基空白对照组。Trizol 法抽提总 RNA，取 2 μg 总 RNA 按SuperScript III 逆转录酶试剂盒说明书合成cDNA。采用 Syber green 法对目的基因进行扩增，相关基因引物如下[5]：

Dectin-1：正向序列 5′ TCAATGTAAGAGGAA GGGTG 3′；反义序列 5′ GCCAAGCTCTCTAAAC ATTT 3′。

IL-12p40：正向序列 5′ CCACATTCCTACTTC TC 3′；反义序列 5′ GTCTATTCCGTTGTGTC 3′。

IL-12p35：正向序列 5′ ACCAGGTGGAGTTC AAGACC 3′；反义序列 5′ TGGCACAGTCTCACT GTTGA 3′。

GAPDH：正向序列 5′ CGGATTTGGTCGTATT GGG 3′；反义序列 5′ CTCGCTCCTGGAAGATGG 3′。

以 2−ΔΔCT法计算目的基因的变化水平，ΔCT=目的基因 CT值 － 内参照（GAPDH）CT值；某一样品的 ΔΔCT= 某一样品 ΔCT－ 最低表达的样品的 ΔCT。LNT 刺激后 1、6、24 h 分别检测Dectin-1 的 mRNA 水平；刺激后 1、4、6 h 分别检测 IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 水平。

1.2.3 ELISA 法测定 IL-12 含量 THP-1 细胞与终浓度分别为 10、5、1 μg/ml 的 LNT 共培养 6 h 后；……