(昆明市延安医院，昆明 650051)

百草枯(PQ)是目前广泛使用的有机杂环类接触性除草剂，人类中毒后可引起多脏器功能损害，其中以急性肺损伤(ALI)表现最为突出［1］，病死率高，至今仍无特效解毒剂。2010年6月，我们观察了三七总皂甙(PNS)对PQ急性中毒大鼠肺损伤的治疗作用并探讨其作用机制，旨在为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD雄性大鼠150只，体质量200～250 g，昆明医学院实验动物中心提供。质量分数为20%的PQ溶液(山东三元工贸有限公司)，试验前稀释为1%。PNS注射液(昆明制药厂)。IL-1β、NF-κB 试剂盒(大连宝生物)，Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基)。

1.2 模型制作及干预 将150只大鼠随机分为三组:PQ组(60只)及PNS组(60只)均予质量分数为1%的PQ 25 mg/kg一次性灌胃染毒制作PQ中毒肺损伤模型，对照组(30只)予等量生理盐水灌胃。制模前15 min PNS组阴茎静脉注射PNS 50 mg/kg;PQ组和对照组分别予等体积生理盐水阴茎静脉注射。

1.3 观察项目 ①肺组织损伤:分别在制模后6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d取血后处死大鼠，肺组织取材后常规石蜡切片，HE染色。光学显微镜下(×200)观察肺组织结构变化。②血浆IL-1β水平:分别于制模后第6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d处理大鼠，取静脉血离心，将血清置－70℃冰箱保存，操作严格按照说明书进行。③肺泡灌洗液中性粒细胞(PMN)NF-κB p65表达检测:大鼠处死后分别予上述时间点收集支气管肺泡灌洗液离心留取上清，沉淀重新悬浮后，进行密度梯度离心，PMN富集层进行瑞氏-姬姆萨染色，PMN纯度＞88%方可进行下一步实验。一抗采用兔抗NF-κB P65多抗，相应生物素标记的第二抗体及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒。阴性对照用PBS代替一抗。体积较小且核分叶的细胞为PMN。操作过程按试剂盒说明书进行。镜下随机选取5个高倍视野，计算NF-κB p65阳性细胞(胞膜、胞质或胞核出现棕黄色着色颗粒)占细胞总数的百分比。④PMN凋亡率:BALF中提纯的PMN悬液经PI染料避光染色10 min后，上流式细胞仪，染色阳性为凋亡细胞，计算凋亡细胞所占百分比。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.5统计软件，计量资料以±s表示，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用秩和检验，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织损伤程度 对照组肺组织结构完整，无炎症细胞渗出。PQ组肺间隔增厚，肺泡壁断裂，大量PMN等炎症细胞浸润，且随时间的延长炎性细胞浸润增多，肺组织损伤程度加重。PNS组肺组织有同PQ组相似的病理表现，但相应时间点肺组织损伤程度较轻。

2.2 相关指标比较 详见表1。

表1 各组鼠血清白介素-1β、NF-κB阳性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

表1 各组鼠血清白介素-1β、NF-κB阳性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

注:与对照组比较，#P＜0.00，与PQ组相应时间点比较，△P＜0.05

组别 IL-1β(μg/mL)NF-κB 阳性率(%)PMN 凋亡率(%)PNS 组6 h 8.56 ±1.28#△ 13.14 ±3.10#△ 25.34 ±4.42#△12 h 10.56 ±2.44#△ 15.47 ±3.48#△ 23.51 ±2.82#△1 d 12.64 ±2.82#△ 19.55 ±4.54#△ 20.78 ±1.69#△3 d 13.72 ±3.27#△ 24.62 ±6.45#△ 18.44 ±2.59#△5 d 9.48 ±2.10#△ 12.83 ±2.72#△ 21.50 ±3.63#△7 d 7.36 ±1.45 8.36 ±2.45 27.87 ±3.47 PQ组6 h 9.92 ±2.12# 16.92 ±4.53# 23.45 ±4.36#12 h 11.86 ±2.64# 20.72 ±5.24# 20.64 ±3.58#1 d 13.57 ±2.95# 26.55 ±5.78# 18.05 ±2.32#3 d 15.93 ±3.23# 30.43 ±7.15# 16.58 ±1.57#5 d 12.46 ±2.58# 15.46 ±3.67# 19.84 ±3.41#7 d 8.86 ±1.24 11.84 ±2.87 24.15 ±3.32对照组6 h 6.25 ±1.43 8.15 ±2.45 29.34 ±4.33 1 d 6.51 ±1.30 7.98 ±1.56 30.50 ±6.62 3 d 6.84 ±1.52 8.50 ±2.33 28.68 ±3.25

3 讨论

PQ进入机体后，造成机体一系列应激反应，激活中性粒细胞及单核巨噬细胞，刺激神经、内分泌和免疫系统释放大量细胞因子、炎症介质等多种生物学效应因子。研究证实，上述炎症介质在PQ中毒急性肺损伤及肺纤维化发生发展过程中起重要作用［2］。

PMN是由骨髓系造血干细胞分化而来的，产生速度快，存活期短(24～48 h)，一旦分化成熟即启动其自发性凋亡［3］。研究表明，细胞凋亡是炎症过程中调控PMN数量和反应性的有效措施，能够保证炎症反应的适度水平，避免炎症反应扩大化，减少自身组织细胞损伤［4］。PMN在肺组织中大量聚集和持续激活，导致其发生呼吸爆发和脱颗粒，释放蛋白酶和各种炎性介质等导致肺损伤。

IL-1β是介导急性炎症反应的一种多肽，在大多数炎症和免疫反应中是关键性的始动信号［5，6］，在肺纤维化发病过程中，IL-1β可调节辅助T淋巴细胞的活性，趋化粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞的积聚，介导肺泡炎症期的损伤;还能刺激肺成纤维细胞增殖，对胶原合成有一定促进作用。有研究表明，急性呼吸窘迫综合征死亡患者血清的IL-1β水平较生存者明显升高，用其血清孵育正常人外周血淋巴细胞可促使淋巴NF-κB p65蛋白成分明显增加，IL-1β mRNA表达水平明显升高［7］。NF-κB作为调节细胞因子网络的枢纽型环节，其活化可引起该网络的调控失衡［8］:一方面能启动众多炎性细胞因子的基因转录和表达，进而形成“炎症级联反应”启动肺部炎症，并通过正反馈的级联放大效应促进肺部炎症的发展;另一方面，许多致肺纤维化因子基因的启动子区域也含有NF-κB的固定的核苷酸κB序列，NF-κB活化后和含有κB序列的DNA结合，启动这些基因的转录和表达，可促进肺纤维化的发生发展。Walley等［9］发现，小鼠气管内注射脂多糖后，支气管肺泡灌洗液细胞NB-κB的活性增强，伴有早期依赖NB-κB的细胞因子IL-1β和TNF-a表达增高。佟飞等［10］应用电泳迁移率改变分析法(EMSA)观察到，NF-κB在PQ染毒大鼠肺组织中的表达增加，表明NF-κB可能参与了PQ中毒肺损伤的发生。

本研究PQ组IL-1 β和NF-κB p65水平明显增加，PMN凋亡率降低，且随时间的延长炎性细胞浸润增多，肺组织损伤程度加重，在整个实验过程中表现出动态变化。提示NF-κB p65和IL-1β可能参与了PQ中毒急性肺损伤，并可能进而影响后期肺纤维化的形成。PNS组 NF-κB p65和 IL-1β表达降低，PMN凋亡率提高，且肺损伤化程度减轻。其可能机制:①PNS能抑制PMN内NF-κB的活化，减少细胞间黏附分子表达及中性粒细胞浸润作用［11］;②PNS可提高小鼠的血清溶血素水平，促进其单核-巨噬细胞碳廓清作用，增强小鼠的单核-腹腔巨噬细胞吞噬能力，提高小鼠NK细胞活性［12］。但其具体机制有待于进一步研究。本研究结果也显示，NF-κB p65与IL-1β关系密切，两者表达具有时间上的一致性，但两者何为始动因素仍待进一步研究。

［1］王永进，王泽惠.百草枯中毒治疗的研究进展［J］.中国急救医学，2003，23(6):404-406.

［2］Jian X，Ruan Y，Guo G，et al.Anti-TGF-betal antibody:an effective treatment for lung injury caused by paraquat in the future［J］.Med Hypotheses，2008，70(3):705.

［3］Maianski NA，Mainaski AN，Kuijpers TW，et al.Apoptosis of neutrophils［J］.Acta Haematol，2004，111(1):56-66.

［4］Ogura H，Tanaka H，Koh T，et al.Priming，second-hit priming，and apoptosis in leukoeytes from trauma Patient［J］.J Trauma，1999，46(5):774-778.

［5］Arai T，Abe K，Matsuoka H，et al.Introduction of the interleukin-10 gene into mice inhibited bleomycin-induced lung injury in vivo［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physid，2000，278(5):914-922.

［6］卫张蕊，周国锋，田琼.炎症细胞和细胞因子在肺纤维化中作用的研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2005，21(z1):85-87.

［7］Meduri GU，Muthiah PM，Pierluigi C，et al.Nuclear factor-kappa B and glucocorticoid receptor alpha-mediated mechanisms in the regulation of systemic and pulmonary inflammation during sepsis and acute respiratory distress syndrome:evidence for inflammation-induced target tissue resistance to glucocorticoids［J］.Neuroimmunomedulation，2005，12(7):321-338.

［8］Ishida Y，Takayasu T，Kimura A，et al.Gene expression of cytokines and growth factors in the lung after paraquat administration in mice［J］.Leg Med，2006，8(2):102-109.

［9］Walley KR，McDonald TE，Higashimoto Y.Modulation of proinflammatory cytokines by nitric oxide in murine acute lung injury［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，160(2):698.

［10］佟飞，田英平，石汉文，等.急性百草枯中毒大鼠肺组织核因子-κB及诱导型一氧化氮合酶表达变化的研究［J］.中国急救医学，2006.26(7):520-522.

［11］唐旭东，姜建青，赁常文，等.三七总皂甙对心肌缺血—再灌注中中性粒细胞浸润的影响及其核转录机制的实验研究［J］.成都中医药大学学报，2002，25(3):3.

［12］赵鹏，李彬，何为涛，等.三七皂苷对小鼠免疫功能影响的实验研究［J］.中国热带医学，2004.4(4):52.