崔 平， 李军会， 南 娜， 康 洁， 申景然

(1.河北省人民医院医务处，河北石家庄050051;2.石家庄麦格明目眼科门诊部，河北石家庄050031;3.河北医科大学第四医院眼科，河北石家庄050011;4.河北省人民医院眼科，河北石家庄050051)

白藜芦醇 (resveratrol，Res)是近年来发现的具有多种生物活性的多酚化合物。近年来，已经证实白藜芦醇具有调节脂质代谢、抑制血小板聚集保护心血管、抗炎等多种生物活性和药理作用，对多种肿瘤 (如鼠肝细胞癌、乳腺癌等)也具有不同程度的抑制作用［1-2］，但对视网膜母细胞瘤的作用研究少见报道。本实验以人视网膜母细胞瘤细胞为研究对象，观察白藜芦醇对其增殖的影响，并初步阐明具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

人视网膜母细胞瘤细胞SO-RB50:购自美国ATCC菌种保藏中心。白藜芦醇、MTT、DMSO购自美国Sigma公司;RT-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH一抗均购自美国 Santa Cruz公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH引物根据GenBank序列设计并委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCNA上游引物:5'-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3'，下游引物:5'-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3'，片段长度302 bp。

Cyclin D1上游引物:5'-CTTCCTCTCCAAAATGCCAG-3'，下游引物:5'-AGAGATGGAAGGGGGAAAGA-3'，片段长度550 bp。

Rb上游引物:5'-CAGACTGATTCTATAGACAG-3'，下游引物:5'-GTTTGTATCGCTGTGATCC-3'，片段长度327 bp。

P16上游引物:5'-CCTGGCTCTGACCATTCTGT-3'，下游引物:5'-GTCCTCACCTGAGGGACCTT-3'，片段长度347 bp。

GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，片段长度452 bp。

1.2 细胞增殖抑制实验 采用MTT法进行检测，具体如下:以104个细胞/孔的密度将视网膜母细胞瘤细胞SORB50接种于96孔板，药物处理组分别加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L白藜芦醇，对照组加0.5%DMSO，每组6个复孔。分别孵育24 h和48 h，在实验结束之前4 h，每孔加入20 μL MTT，继续孵育4h，实验结束后，离心弃去培养液，每孔加入DMSO 150 μL，于室温轻微溶解结晶15 min，用酶标仪测定吸光度OD490值。

1.3 细胞周期分析 视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞分别加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 白藜芦醇孵育48 h，经胰酶消化后收集细胞并在细胞中加入1 mL 70%的乙醇，混匀，上Becton Dickinsor FACscan流式细胞仪检测 SORB50细胞周期分布情况。

1.4 RT-PCR检测 视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞加入50 μmol/L白藜芦醇，对照组加入等体积0.5%DMSO孵育24 h后收集细胞，按照Trizol试剂说明书，采用一步法提取各组细胞总RNA。在测定完总RNA浓度和纯度后，取等量RNA进行反转录制备cDNA。之后在Taq酶的作用下进行PCR反应，扩增目的片段。PCR参数设置为预变性95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，在完成25个循环后，72℃延伸10 min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳(80 V 1 h)分离，结果用凝胶成像分析系统进行图像扫描及密度分析。以GAPDH条带作为内参照，以目的片段条带密度值/GAPDH条带密度值的比值进行分析。

1.5 Western blot分析 视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞加入50 μmol/L白藜芦醇，对照组加入等体积0.5%DMSO孵育48 h后收集细胞，加入冰的细胞裂解液提取细胞总蛋白，定量完毕，实验组和对照组均取60 μg蛋白样品煮沸变性后，进行10%SDS-PAGE电泳。根据蛋白marker的指示，将含有目的条带的凝胶转到PVDF膜上，依次进行:5%脱脂奶粉室温1 h;相应一抗4℃过夜;TBST漂洗3次后加相应二抗37℃ 1.5 h;TBST漂洗3次后，ECL发光法显色;最后对条带进行吸光度积分扫描。以GAPDH条带作为内参照，以目的片段条带密度值/GAPDH条带密度值的比值进行分析。

2 结果

2.1 对视网膜母细胞瘤细胞增殖活性的影响 MTT分析检测结果表明，在 6.25、12.5、25、50 μmol/L浓度范围内的白藜芦醇作用24h及48h，均能抑制SO-RB50细胞增殖，且抑制效应与白藜芦醇作用浓度呈依赖关系。其中50 μmol/L白藜芦醇处理视网膜母细胞瘤细胞48 h时抑制作用已较为明显，而100 μmol/L浓度并不能使抑制作用进一步增强 (均P＜0.05)。见表1。

表1 白藜芦醇对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞OD值的影响(%，±s，n=6)

表1 白藜芦醇对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞OD值的影响(%，±s，n=6)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

剂量/(μmol·L-1)24 h 48 h对照组1.58 ±0.39 1.67 ±0.386.25 1.16 ±0.31 1.12 ±0.29*12.5 1.01 ±0.29* 0.93 ±0.36＊＊25 0.97 ±0.23＊＊ 0.89 ±0.25＊＊50 0.84 ±0.26＊＊ 0.76 ±0.26＊＊100 0.86 ±0.15＊＊ 0.79 ±0.24＊＊

2.2 细胞周期分析 流式细胞术结果显示，12.5、25、50、100 μmol/L白藜芦醇处理后，SO-RB50细胞周期分布发生了改变，即处于 G1期的SO-RB50细胞数明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，处于S期的SO-RB50细胞数显著减少 (P＜0.05，P ＜0.01)。见表2。

2.3 对视网膜母细胞瘤细胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表达的影响 RT-RCR结果显示，50 μmol/L白藜芦醇作用视网膜母细胞瘤细胞48 h后，视网膜母细胞PCNA和Cyclin D mRNA表达水平显著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和 P16 mRNA水平显著上升 (P＜0.01)。见表3，图1。

表2 白藜芦醇作用对SO-RB50细胞周期分布的影响(±s，n=6)

表2 白藜芦醇作用对SO-RB50细胞周期分布的影响(±s，n=6)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

剂量/(μmol·L-1) G1期/% S期% G2/M期/%对照组12.2 ±5.656.7 ±7.8 26.8 ±5.2 16.5 ±4.66.25 62.9 ±8.2 22.5 ±6.5 14.6 ±4.512.5 68.4 ±9.8* 19.2 ±3.5* 12.4 ±3.625 76.1 ±10.1＊＊ 11.6 ±3.3＊＊ 12.3 ±4.750 78.8 ±11.9＊＊ 10.1 ±2.8＊＊ 11.1 ±5.4100 77.3 ±9.9＊＊ 10.5 ±3.1＊＊

表3 白藜芦醇对SO-RB50细胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表达的影响(±s，n=6)

表3 白藜芦醇对SO-RB50细胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表达的影响(±s，n=6)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01。

mRNA PCNA Cyclin D Rb P16对照组组别1.38 ±0.34 0.83 ±0.19 0.09 ±0.02 0.29 ±0.07白藜芦醇组 0.43 ±0.08＊＊0.38 ±0.08＊＊0.60 ±0.13＊＊ 1.02 ±0.28＊＊

图1 PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA的表达情况(RT-PCR)

2.4 对视网膜母细胞瘤细胞 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表达的影响 Western blot结果显示，50 μmol/L白藜芦醇处理视网膜母细胞瘤细胞48 h后，PCNA和Cyclin D蛋白水平显著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和P16蛋白水平显著上升 (P＜0.01)。见表4，图2。

表4 白藜芦醇对SO-RB50细胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表达的影响(±s，n=6)

表4 白藜芦醇对SO-RB50细胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表达的影响(±s，n=6)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01。

PCNA Cyclin D Rb P16对照组组别 蛋白0.96 ±0.25 0.95 ±0.17 0.33 ±0.04 0.30 ±0.06白藜芦醇组 0.38 ±0.05＊＊0.51 ±0.06＊＊0.87 ±0.14＊＊ 0.78 ±0.13＊＊

3 讨论

图2 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白的表达情况(Western blot)

由于放化疗等措施对于机体的副作用大，且在许多恶性肿瘤的治疗中治疗效果有限，故近年来中药提纯物作为恶性肿瘤辅助治疗药物受到了越来越多的关注，且研究已取得许多成果［3-4］。视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，其发生主要是由于Rb基因的缺失或失活导致细胞周期调控异常所致。RB生长迅速、恶性度高、转移早，严重危害患儿的视力及生命。有研究表明，白藜芦醇可明显抑制不同癌细胞增殖，但是，笔者未见到关于白藜芦醇是否影响人视网膜母细胞瘤细胞增殖的报道。本研究发现，6.25～100 μmol/L范围内白藜芦醇均能显著抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，且抑制效应与白藜芦醇的作用时间呈依赖关系。随后进行了流式细胞术以明确白藜芦醇对视网膜母细胞瘤细胞周期的具体影响，结果显示，不同浓度的白藜芦醇作用后，处于G1期的SORB50细胞数明显增加，处于S期的SO-RB50细胞数显著减少，且50 μmol/L白藜芦醇作用48 h时变化最明显，提示白藜芦醇具有明显的抗人视网膜母细胞瘤细胞增殖的作用，这一作用是白藜芦醇通过调控肿瘤细胞周期实现的。

本研究为探讨白藜芦醇抑制人视网膜母细胞瘤增殖的机制，检测了与细胞周期密切相关的蛋白，这些调节因子的表达失衡可导致肿瘤的发生。其中，PCNA能够反映细胞增殖分数和所处周期的客观指标，也可以作为判定肿瘤的恶性程度及预后的重要指标［5］;CyclinD1是细胞周期重要的正调控因子，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的促进作用［6］，若CyclinD1基因发生改变，则有可能导致细胞周期的异常调控，进而导致细胞转化甚至癌变［7］。我们的结果显示用药前SO-RB50细胞呈现PCNA、Cyclin D高表达，应用白藜芦醇后PCNA、Cyclin D表达均下调，结合FCM所测得的细胞周期结果，表明白藜芦醇是通过下调PCNA、Cyclin D发挥抗肿瘤的作用。

临床中视网膜母细胞瘤的发生是一个涉及多重基因事件的复杂过程，仅一种癌基因缺失或突变不足以导致肿瘤的发生和发展，而是多个激活的癌基因与失活的抑癌基因之间的协同作用的结果，因此我们进一步研究了白藜芦醇对抑制癌基因的作用。Rb和P16均是重要的抑制癌基因。Rb对细胞周期的调控作用主要是通过和E2F结合，从而阻止细胞从G1期进入S期，使细胞周期停滞［8-9］。P16基因是近年研究发现的多种肿瘤抑制基因，作为细胞周期素依赖性激酶 (CDK)的抑制蛋白，与细胞周期蛋白共同推进细胞周期进程，它的失活或缺失，会导致CDK过度作用，造成细胞非正常增殖［10］。我们的研究表明白藜芦醇作用后抑癌基因Rb和P16 mRNA和蛋白表达均显著下降，结合细胞周期相关因子PCNA、Cyclin D的结果进行综合分析，我们认为白藜芦醇可体外抑制SO-RB50增殖，其抑制作用是通过抑制PCNA和Cyclin D转录和翻译、促进Rb和P16转录和翻译，进而抑制细胞周期进程实现的。但阐明白藜芦醇抗SO-RB50肿瘤活性机制仍需进一步研究。

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