RP-HPLC法同时测定痛经宁胶囊中4种有效成分

2012-07-26黄文君龙凤荣

中成药 2012年11期

黄文君，龙凤荣，伍庆，乙引，洪江

(1.贵州师范大学，贵州贵阳550001;2.贵州弘康药业有限公司，贵州贵阳550001;3.贵州科学院，贵州贵阳550001)

痛经宁胶囊由白芍、丹参、当归等九味药材组成，具有活血化瘀，行气散寒，调经止痛等功效，用于月经不调，经前、行经期腹痛等［1-2］。目前，对痛经宁胶囊质量标准的研究较少，主要是针对芍药苷的定量测定［3］，该方成分复杂多样，单指标难以有效反应制剂质量。丹参活血调经，祛瘀止痛，养血安神，为方中臣药，其水溶性活性成分丹参素理气止痛，原儿茶醛可抑制血小板凝聚，丹酚酸B活血化瘀，通经活络［4-6］，均为该制剂有效成分。为了更好的控制痛经宁胶囊的质量，故本实验选择丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和芍药苷为检测对象，经过对色谱条件的摸索与优化，建立了RP-HPLC法同时测定痛经宁胶囊中丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷、丹酚酸B 4种有效成分。该法简单快速、稳定可靠，为更好的控制该制剂质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent色谱工作站 (安捷伦科技有限公司);CH—250超声波清洗仪 (北京创新德超声电子研究所);XS205DU电子分析天平 (梅特勒-托利多)。

1.2 试药丹参素钠对照品 (批号:110855-200507)、原儿茶醛对照品 (批号:110810-200506)、芍药苷对照品 (批号:110736-200629)、丹酚酸B对照品 (批号:111562-200803)均购于中国药品生物制品检定所。痛经宁胶囊为市售(批号:20110301，20110401，20110801，贵州弘康药业有限公司生产)。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水 (自制)，其余试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-乙腈 (2∶1)(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱 (0 min，7%A;15 min，22%A;30 min，31%A;50 min，53%A)，体积流量1 mL/min;柱温30℃;检测波长230 nm;进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取原儿茶醛对照品6.52 mg置10 mL量瓶中，加稀乙醇 (529→1000，下同)稀释至刻度，制成0.652 mg/mL的对照品溶液。精密称取对照品丹参素钠8.78 mg、芍药苷10.41 mg、丹酚酸B 5.72 mg，精密吸取上述原儿茶醛对照品溶液0.5 mL置于同一25 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，制成丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷、丹酚酸B质量浓度分别为0.3512 mg/mL、0.01304 mg/mL、0.4164 mg/mL 和0.2288 mg/mL的混合对照品贮备液。精密吸取上述对照品贮备液1 mL于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，制成丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷、丹酚酸 B质量浓度分别为 70.24 μg/mL、2.608 μg/mL、83.28 μg/mL 和 45.76μg/mL 的混合对照品溶液，供定量测定用。

2.2.2 供试品溶液的制备取痛经宁胶囊内容物，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备参照制剂的工艺过程，按处方比例分别配置不含白芍和丹参的阴性样品，照2.2.2项下方法操作，制备阴性供试品溶液。

2.3 系统适用性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液分别注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，结果丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷、丹酚酸B的理论塔板数均不低于10000，与相邻成分达到基线分离，且阴性对照无干扰。对照品、样品与阴性样品的色谱图见图1。

2.4 线性关系试验分别精密吸取上述混合对照品贮备液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀。按2.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，以峰面积值(Y)对进样量 (X，μg)进行线性回归，得丹参素钠回归方程为 Y =953.53X －2.6216(r=0.9999);原儿茶醛回归方程为 Y=5022.6X+1.8974(r=0.9996);芍药苷回归方程为Y=1285.2X+2.9049(r=0.9998);丹酚酸B回归方程为Y=1995.1X+12.878(r=0.9999)。结果表明，丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B分别在 0.14048 ～1.4048 μg，0.00522 ～0.0522 μg，0.16656 ～1.6656 μg 和 0.09152 ～0.9152 μg范围内线性关系良好。

图1 对照品 (A)、样品 (B)、丹参阴性样品 (C)和白芍阴性样品 (D)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)， sample(B)，negative sample without Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma(C)and negative sample without Paeoniae Radix alba(D)

2.5 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，按峰面积计算RSD值，结果丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B的RSD分别为0.82%、1.43%、0.96%和1.61%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱峰面积，结果丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.45%、1.26%、0.98%和1.83%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.7 重复性试验取同一批号 (20110801)痛经宁胶囊内容物粉末，照2.2.2项下方法操作，平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算含有量，结果丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B含有量的RSD分别为1.12%、2.03%、0.76%、1.58%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含有量的痛经宁胶囊 (批号:20110801)9份，每份约0.15 g，置25 mL量瓶中，分别精密加入上述混合对照品贮备液1.6、2.0、2.4 mL，各平行3份，加稀乙醇适量，超声处理30 min，放冷，用稀乙醇加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品测定取3批样品，照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算各自质量分数，结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择经紫外-可见分光光度计扫描，丹参素钠分别在207、221、282 nm处有吸收峰，原儿茶醛分别在207、231、280、312 nm处有吸收峰，芍药苷分别在202、230、275 nm处有吸收峰，丹酚酸B分别在206、224、254、286、308 nm处有吸收峰。结合相关文献［7-8］，本实验比较了230 nm与280 nm波长下样品的吸收，实验结果表明采用230 nm同时测定4种成分时的响应值和峰形优于采用280 nm测定结果。

3.2 提取条件的选择由于丹酚酸B的热不稳定性［9］，故选择超声提取。丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B均为水溶性成分，本实验考察了纯水，稀乙醇，95%乙醇，50%甲醇及80%甲醇的提取效果，结果表明，稀乙醇与50%甲醇优于其他溶剂，二者对丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷的提取率相当，而稀乙醇对丹酚酸B的提取率高于50%甲醇;进一步试验，以稀乙醇为提取溶剂，分别超声提取20、30、45 min，发现超声提取30 min各组分均可提取完全。故本实验选择稀乙醇作提取溶剂超声提取30 min制备供试品溶液。

3.3 流动相的选择由于丹参素钠、原儿茶醛、芍药苷和丹酚酸B均为酸性化合物，为改善其拖尾现象，故在流动相中加入酸来改善峰形，而醋酸在230 nm有吸收，容易发生基线的漂移，因此选择加入磷酸，同时结合相关文献资料［10-13］，也比较了甲醇与乙腈的分离效果，选择了甲醇-乙腈(2∶1)(A)－0.05%磷酸 (B)系统，经梯度洗脱优化，最终确定了上述最佳流动相。