郑莉莉，李 佳，房 林

(同济大学附属第十人民医院甲乳外科，上海 200072)

原发性肝癌在世界范围内是第五位最常见和第三位致死率最高的恶性肿瘤。我国是原发性肝癌的高发区，占全球肝癌病例的55%。因此，对原发性肝癌发生发展分子机制进行探讨、研究具有十分重要的意义。近10年来，大量研究表明microRNAs参与了肿瘤的形成和演进［1-4］。在肝癌中，研究者发现肝癌组织中microRNAs表达与配对正常组织明显差异。目前尚不知miR-200a在肝癌中表达情况及其功能，因此本研究运用荧光定量PCR检测miR-200a在肝癌细胞HepG2和正常肝细胞QSG-7701中表达水平，后行功能试验探索其对于HepG2细胞增殖、周期、凋亡和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

人肝癌细胞HepG2和正常肝QSG-7701细胞株购于中国科学院。

1.2 miRNAs提取和逆转录

按照TIANGEN公司miRcute microRNA提取分离试剂盒说明书进行操作。microRNAs逆转录参照Chen等［10］的方法，通过特异茎环引物，按照下列顺序在PCR试管中加入反应物(体积为8.6 μl):超纯水 2 μl，5 × buffer 1.7 μl，microRNAs 茎环引物(各个 microRNAs 及内参 U6)1.9 μl，逆转录酶(Primescript RT Enzyme MixI)1 μl，microRNAs sample 2 μl。反应条件为:16、42、85、4 ℃ 10 min，反应结束后置于4℃冰箱保存。

1.3 实时定量RT-PCR

按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)DRR041A说明书完成加样，反应条件为95℃预变性2 min;变性95℃ 30 s，退火、延伸60℃45 s，重复35个循环，70℃ ～95℃绘制融解曲线。反应结束后，RQ manager分析软件统计处理，获取Ct值，并根据熔解曲线判断产物的纯度。

1.4 细胞增殖检测

HepG2细胞计数后，用含10%FBS的DMEM培养基以按25×104个细胞/孔接种于6孔板上。待六孔板细胞密度长到约80% ～90%时，按照TIANGEN公司脂质体说明书，以1 μg miR-200a mimics:3 μl脂质体比例完成miR-200a转染，并使miR-200a终浓度分别达到 50、100、150 nmol/L，空对照组为脂质体处理组，负对照组为小分子RNA片段转染组，均不加miR-200a mimics。……