李兴红， 乔广行， 黄金宝， 林 雪， 刘建华＊

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097；2.北京市大兴区植保植检站，北京 102600）

由灰葡萄孢（BotrytiscinereaPer.ex Fr.）引起的番茄灰霉病是保护地番茄上的重要病害，在春季发生，主要引起果实腐烂，也危害叶片和花，严重时造成减产30%～50%。化学防治是防治番茄灰霉病的重要手段之一，所使用的杀菌剂主要有苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类及其混剂和苯胺基嘧啶类等。在生产上灰霉病菌对杀菌剂多菌灵、腐霉利和乙霉威等产生抗药性非常普遍［1－4］，目前生产上控制番茄灰霉病菌的药剂主要是嘧霉胺及复配制剂。

嘧霉胺属于苯胺基嘧啶类杀菌剂，20世纪80年代初由安万特公司研发成为产品问世。1998年在中国登记商品施佳乐原药，目前已在中国登记的有20%和40%嘧霉胺可湿性粉剂，对由灰葡萄孢引起的灰霉病有良好的抑制作用［5］。

苯胺基嘧啶类杀菌剂作用位点单一，灰葡萄孢对嘧霉胺的抗药性为单基因抗性［6］，抗药性风险高。嘧霉胺自1998年开始在中国使用后4年，纪明山报道了辽宁省番茄灰霉病菌对嘧霉胺产生了抗药性［7］，江苏［8］、浙江［9］也相继报道了灰葡萄孢对嘧霉胺产生了抗药性。

北京地区番茄灰霉病害的发生和危害也十分严重，目前生产上主要使用嘧霉胺等杀菌剂防治，北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性如何，生产上应如何合理用药，针对该问题作者于2009年12月—2010年5月间对北京12个郊区县番茄灰霉病菌对嘧霉胺抗药性进行了检测，以明确番茄灰霉病菌对该类药剂的抗药性水平，为正确指导农民用药，减缓病原菌抗药性的产生提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株的采集与分离

2009年12月－2010年5月，在北京12个郊区县日光温室或塑料大棚内，采集番茄病样150个，将病样保湿产生新鲜的子实层，从中挑取单个分生孢子进行培养，纯化得到109个单孢菌株（表1），斜面和滤纸片法低温（－20℃）保存，供抗药性测定使用。

1.2 供试药剂与培养基

将95%嘧霉胺原粉（由江苏利民化工股份有限公司提供）溶于丙酮，配制10 000μg／mL的母液，置于4℃冰箱中存放备用。

L－asp培养基：K2HPO4、MgSO4·7H2O各1g分别溶于30mL去离子水中，将两者混合后用10mol／L HCl溶解沉淀物，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，天冬酰胺2g，葡萄糖22g，琼脂20g，加蒸馏水至1L。

1.3 含药培养基制备

将嘧霉胺母液系列稀释，按一定的比例加入到培养基中，制成系列浓度的含药培养基（在培养基灭菌后，温度降到40℃左右时加入药剂）。

1.4 番茄灰霉病菌对嘧霉胺敏感性的测定

采用菌丝生长速率法，将所有单孢菌株在含药平板上进行对嘧霉胺的抗药性测定。抗药性测定设置5～7个梯度浓度，以不加药剂的为对照；每处理重复3次；在新鲜的菌落边缘打取直径5mm的菌饼，接种于含药培养基的平板中央，在23℃黑暗培养72h，测量菌落直径。根据菌落在不同浓度药剂平板上的线性生长速率，计算出各浓度下对病原菌的生长抑制率，用统计软件DPS进行处理，求出EC50值（抑制中浓度）、EC90值、毒力回归方程及相关系数，并统计各地区的敏感抗性菌株的发生频率。

表1 供试番茄灰霉病菌菌株及其来源

1.5 抗药性程度划分标准

抗性水平依据纪明山等［7］的敏感基线值（0.091 1μg／mL）进行判别，当菌株的EC50值小于敏感基线的5倍时，即EC50小于0.455 5μg／mL时为敏感菌株；当菌株的EC50值处于敏感基线的5倍和10倍之间时，即EC50在0.455 5～0.911μg／mL之间时为低抗菌株，当菌株的EC50值处于敏感基线10倍和40倍之间，即EC50在0.911～3.644μg／mL时为中抗菌株；当某菌株的EC50值大于敏感基线的40倍，即EC50高于3.644μg／mL时为高抗菌株。

2 结果与分析

2.1 北京地区灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

经分离共获得109株番茄灰霉病菌，采用菌丝生长速率法测定嘧霉胺对各菌株的EC50值。结果表明（表1）：北京地区郊区县的番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性已经产生分化，抗性比例较高，抗性菌株出现的比例高达82.57%，其中高抗菌株为主所占比例为65.14%，其次为低抗菌株和中抗菌株，分离比例分别为10.09%和7.34%；敏感菌株所占比例为17.43%。抗性菌株抗性水平最高的BJPGngx15－1EC50达到257.390 3μg／mL，与最敏感菌株相比（EC50为0.050 5μg／mL），EC50值是敏感菌株的5 096倍。说明北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性非常普遍，且以高抗菌株为主；在该地区应采用新型替代药剂。

表2 北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性表型及其频率1）

1）HR表示高抗，MR表示中抗，LR表示低抗，S表示敏感。

2.2 北京地区不同区、县番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性差异

比较北京地区各郊区县抗嘧霉胺番茄灰霉菌株的频率和程度，结果显示（图1）：不同郊县番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性存在明显差异，这可能与各区县的种植方式和用药水平有关。门头沟区、密云县、延庆县、怀柔区和平谷区番茄灰霉病菌存在抗性问题较为突出，抗性菌株发生频率均为100%，抗性程度也较高，高抗菌株所占比例在80%以上；通州区的抗性菌株发生频率为95%，且都为高抗菌株，5%的菌株为敏感菌株；与之相反，海淀区和朝阳区的菌株均为敏感菌株；房山区、大兴区、顺义区和昌平区的抗性菌株频率居中，依次为54.55%、77.78%、85%和88.88%；其中，房山区的抗性菌株中未出现高抗菌株，而后3个区的抗性菌株中以高抗菌株为主，所占比例分别为66.67%、70%和44.44%。

图1 北京市不同区县番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性测定结果

3 结论与讨论

试验结果表明，北京地区自20世纪末开始使用嘧霉胺防治番茄灰霉病，在10余年的时间内，番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性非常普遍，抗性菌株出现的比例高达82.57%，抗性水平以高抗为主，在抗性菌株中，高抗菌株所占比例达78.89%，抗性水平最高的菌株EC50是最敏感菌株EC50值的5 096倍；不同区县番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性存在差异，这可能与番茄种植方式和用药水平有关，海淀区、朝阳区未检测到抗性菌株，房山区未检测到高抗菌株，这两区的病样分别采自巨山农场、朝阳农艺园和韩村河蔬菜基地，巨山农场是有机农场，朝阳农艺园和韩村河蔬菜基地都是加温温室，灰霉病发生较轻，用药较少；而门头沟区、密云县、延庆县、怀柔区、平谷区、大兴、顺义和通州等区县的番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性普遍，抗性水平高，这些地区番茄主要是不加温日光温室栽培，灰霉病防治多采用嘧霉胺，药剂的长期施用对病菌的选择压力导致抗药性产生。

灰葡萄孢对嘧霉胺的抗药性是由单基因抗性控制［6］，易形成抗药性，这种现象在国内外生产实践中得到证实，本研究结果与相关报道相符。

有研究表明，灰霉病菌对嘧霉胺的抗性可稳定遗传，抗性菌株与敏感菌株的适应性无差异，表现在菌丝生长和产孢能力等方面，因此，嘧霉胺在北京地区防治番茄灰霉病应慎重使用，抗性严重的门头沟区、密云县、延庆县、怀柔区和平谷区、通州等区县应停用，使用替代型杀菌剂及其他生态措施和生物农药；在抗性水平低的区县应减少嘧霉胺的使用量，交替使用新型杀菌剂及其他生物、生态等综合控制技术，减缓抗药性的产生。

［1］Elad Y，Shabi E，Katan T.Negative cross resistance between benzimidazole and N－phenylcarbamate fungicides and control ofBotrytiscinereaon grapes［J］.Plant Pathology，1988，37（1）：141－147.

［2］Elad Y，Yunis H，Katan T.Multiple fungicide resistance to benzimidazole，dicarboximides and diethofencarb in field isolates ofBotrytiscinereain Israel［J］.Plant Pathology，1992，41（1）：41－46.

［3］李林，徐作珽.山东省灰霉菌对速克灵、多菌灵田间抗性检测研究初报［J］.山东农业科学，1997（3）：32－35.

［4］林柏青，姚技强，朱国仁.北京郊区大棚蔬菜灰霉病菌的抗药性检测［J］.植物保护，1998，24（2）：30－31.

［5］马忠华，叶钟音.嘧啶胺类杀菌剂的作用机制［J］.农药科学与管理，1997，19（1）：30－32.

［6］Hilber U W，Hilber B M.Genetic basis and monitoring of resistance ofBotryotiniafuekelianato anilinopyrimidines［J］.Plant Disease，1998，82（5）：496－500.

［7］纪明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性［J］.植物保护学报，2003，30（4）：396－399.

［8］贾晓华.番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌对嘧霉胺的敏感性基线及番茄灰霉病菌抗药性研究［D］.南京：南京农业大学，2004.

［9］印利梅，礼茜，李红叶.浙江省茄科蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性［J］.浙江农业学报，2007，19（2）：123－126.