黄妤，周晶辉，乔波，赵燕，张学文*

(湖南农业大学a.生物科学技术学院；b.信息科学技术学院，湖南 长沙410128)

生长素参与植物生长和发育的诸多过程，研究其作用机制对深入认识植物生长发育的生理过程有重要意义[1-3]。目前已从玉米[4]、陆地棉[5]、辣椒[6]、烟草[7]等植物中分离出生长素结合蛋白 ABP1(auxin-binding proteins)。有研究表明，ABP1在植物生长素的运输过程中具有与生长素结合并转运到其他组织细胞的功能。笔者以苎麻(Boehmeria nivea)[8-9]为材料，运用RT-PCR，克隆了苎麻生长素结合蛋白 ABP1基因 cDNA(GenBank登录号：EU195804)，并对其进行了表达分析[10]。在此基础上将其与绿色荧光蛋白(green fluorescen protein，GFP)[11-16]融合进行了烟草的遗传转化，以此对目标蛋白进行标记，更深入探讨该生长素调控的途径。将已克隆的苎麻生长素结合蛋白 ABP1基因cDNA，亚克隆到 GFP绿色荧光蛋白表达质粒pCAMBIA1300-GFP中，构建了 BnABP1 与 GFP融合表达载体pCAMBIA1300-GFP –BnABP1。采用根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法进行了烟草的遗传转化。获得的转基因烟草采用荧光显微镜观察，初步分析了苎麻生长素结合蛋白 BnABP1在细胞中的定位和分布情况。

1 材料与方法

1.1 材 料

烟草品种 WS38。烟草采用 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA(MS1)进行愈伤组织诱导和发芽，采用MS+ 0.05 mg/L NAA(MS2)诱导生根。大肠杆菌(Escherichia coli)Top10 和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，克隆的苎麻BnABP1基因 cDNA(pMD-BnABP1)质粒由湖南农业大学细胞生物学实验室保存，pCAMBIA1300-GFP质粒由北京生命科学研究所惠赠。

1.2 方 法

1.2.1 pCAMBIA1300-BnABP1的构建及工程根癌农杆菌的获得

通过 BioEdit 软件分析苎麻 BnABP1 基因中的酶切位点，结合 pCAMBIA1300 载体上的多克隆位点，考虑基因片段的融合表达，目的片段大小约为600 bp，在克隆载体pMD-BnABP1的上、下游分别引入 KpnⅠ 和 XbaⅠ 核酸限制内切酶的酶切位点，设计引物：上游引物 P1，5′-CGGGGTACC ATGGGTTGGTCTTCGATTCC-3′；……