李 延田 伟马中龙

（1黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨和平路24号，150040；2黑龙江中医药大学；3中国传统医学开发研究中心）

加味血府逐瘀汤抗肿瘤作用的实验研究

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（1黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨和平路24号，150040；2黑龙江中医药大学；3中国传统医学开发研究中心）

目的：研究加味血府逐瘀汤对小鼠腹水型H22移植性肿瘤模型的抗肿瘤作用和对VEGF的影响。方法：昆明种雄性小鼠100只，接种H22肝癌细胞，建立小鼠腹水型H22移植性肿瘤模型，随机分为10组，分别给予生理盐水、卡培他滨、加味血府逐瘀汤（高、中、低剂量）灌胃，连续10天，第11天处死，观察抑瘤率、生命延长率的变化；用免疫组化方法检测VEGF在肿瘤中的表达，SPSS13.0软件作统计学分析。结果：卡培他滨、加味血府逐瘀汤（高、中、低剂量）组的抑瘤率分别为60%、49%、41%、35%，生命延长率分别为1.68%、157.98%、70.58%、49.57%。结论：加味血府逐瘀汤能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖，明显延长荷瘤小鼠的生存时间，降低肿瘤组织和瘤周组织中的VEGF表达。

加味血府逐瘀汤；H22小鼠模型；抑瘤率；生命延长率

原发性肝癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤，由于起病隐匿，确诊时多已属中晚期，治疗效果差，预后恶劣，严重威胁人们的生命与健康。故研发安全有效的治疗HCC的药物和方法，是国内外广大医务工作者的重要课题。我们研究了加味血府逐瘀汤对小鼠腹水型H22移植性肿瘤模型的抗肿瘤作用和对VEGF的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种清洁级小鼠100只，雄性，体重18～22g，6～8周龄。购自黑龙江中医药大学实验动物中心，置于温度20℃左右，湿度63%左右，室内，以普通小鼠饲料喂养。

1.2 肝癌瘤株 小鼠H22腹水型肝癌瘤株，购自黑龙江肿瘤病防治研究所，清洁级昆明种小鼠传代。

1.3 实验药物 加味血府逐瘀汤：由黑龙江中医药大学附属医院药厂制备，每毫升含生药1g。然后根据所需浓度再加以浓缩。卡培他滨（希罗达）：购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，上海罗氏制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20073024。

1.4 实验仪器 医用净化工作台（苏州净化设备厂），电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），超低温冰箱（日本三洋公司），光学显微镜（日本Olympus光学仪器公司），CAPP微量加样器（丹麦产200μL、10μL）。

1.5 实验制剂 无水乙醇、二甲苯、苏木素液、双氧水溶液、氢氧化钠溶液等试剂均购自哈尔滨万腾医疗器械化学试剂批发站。小鼠VEGF抗体，辣根标记抗兔PV-6011（二抗）、辣根标记抗小鼠PV-6002（二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司生产。

1.6 实验方法 建立小鼠H22肿瘤模型，造模24h后，根据随机数字表将50只模型小鼠随机分成5组，每组10只。灌胃给药10天，每日1次。模型组（A组）：给予0.9%NaCl 0.4mL/20g，阳性对照组（B组）：给予希罗达375mg/kg，0.4mL/20g，JW低、中、高剂量组（C、D、E组）：分别给予加味血府逐瘀汤12.5g/kg、25g/kg、50g/kg，0.4mL/20g。将其余50只模型小鼠根据体重分层随机分为5组，每组10只，组别和给药剂量同前。每日灌胃给药，连续10天后，改为每3天给药1次。

1.7 检测指标 抑瘤率：末次给药24h后，称小鼠体重，用脊髓脱臼法处死小鼠，右上肢腋下皮肤常规消毒，剥离腋窝处瘤体，分析天平称取瘤重，计算抑瘤率。生命延长率：给药10天后开始记录各组动物死亡时间（以天为单位计算）。结果用平均存活天数和生命延长率表示。VEGF：制作病理切片，用免疫组化方法检测VEGF。免疫组化实验结果判定标准：每组随机选取10个高倍视野（×400），计数1000个癌细胞，计算出阳性细胞数百分比。VEGF阳性表达为肿瘤细胞浆内出现棕黄色颗粒。计算结果后用数码相机照相。

1.8 统计学方法 统计使用SPSS13.0软件分析。

2 结果

2.1 抑瘤率 将肿瘤取出后，称取瘤重，计算平均瘤重及抑瘤率。结果显示，生理盐水组肿瘤明显重于其他4组，抑瘤率以西药组最高，加味血府逐瘀汤各剂量组也有明显的抑瘤作用，其结果见表1。

表1 加味血府逐瘀汤对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

2.2 对生命延长率的影响 加味血府逐瘀汤能明显延长H22肝癌荷瘤小鼠的生存时间，与模型组和阳性对照组比较具有统计学意义（P＜0.01），结果见表2。

表2 对H22肝癌荷瘤小鼠生命延长率的影响

2.3 免疫组化实验结果 A组VEGF表达明显高于其他4组，组间比较具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），加味血府逐瘀汤中、高剂量组与希罗达组比较无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表3。

3 讨论

原发性肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，目前仍以手术治疗为主，但术后复发率高，5年生存率较低，且多数患者发现时已经失去了手术治疗的机会，其他治疗手段也不甚理想。近年来中医药治疗肿瘤越来越受到国内外同仁的关注和认同，我们将血府逐瘀汤加入山慈菇、人参、蜈蚣，组成加味血府逐瘀汤，对H22肝癌荷瘤小鼠进行了抗肿瘤作用的研究。

表3 对H22肝癌腹水瘤荷瘤鼠VEGF表达率的影响

本课题研究结果显示加味血府逐瘀汤能明显抑制H22肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为35%、41%、49%，虽然作用弱于卡培他滨组（60%），但本实验显示加味血府逐瘀汤的抑瘤作用与剂量呈正相关，如果加大剂量，其作用还会有所增强，我们将进一步研究。

评价一个抗肿瘤药物的优劣，最主要的是看其疗效和对生活质量的影响，疗效中应以生存时间为首位。本实验结果显示加味血府逐瘀汤低、中、高剂量组对H22肝癌荷瘤小鼠的生命延长率分别为49.57%、70.58%、157.98%，与阳性对照组（卡培他滨组为1.68%）比较均具有统计学意义（P＜0.01），说明加味血府逐瘀汤能明显延长H22肝癌荷瘤小鼠的生存时间。结果表明加味血府逐瘀汤组对荷瘤小鼠体重无明显影响，且精神状态较模型组和阳性对照组均佳。

VEGF（血管内皮生长因子）是促进血管新生最重要的生长因子，是现今为止所知的作用最强的促血管生成因子，可促进血管内皮增殖、迁移，调节内皮细胞的凋亡通路，阻碍内皮细胞凋亡过程，它是一种选择性促内皮细胞有丝分裂原，通过与VEGF受体结合，增加血管通透能力，引起一系列信号传导，促进内皮细胞的增殖，对肿瘤的浸润转移具有重要的意义。VEGF可促进血管内皮分裂，促进血管新生，增加血管通透性，促进血浆纤维蛋白的外渗，产生纤维网格，有利于毛细血管网及肿瘤间质的形成［1］。肝癌的血管生成对于肝癌的发生、侵袭、转移具有重要的作用［2-3］。有研究表明，实体瘤达到2～3mm3时，如果没有新的血管生成，肿瘤将不再生长且不会发生转移，一直处于“冬眠状态”［4］。肝癌是典型的多血管肿瘤，因而抗血管治疗是一种最有希望的治疗方法。因此，通过观察药物对瘤体中VEGF的表达的影响可以探讨其作用机制。

实验结果显示A组VEGF表达明显高于其他4组，组间比较具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），加味血府逐瘀汤中、高剂量组与希罗达组比较无统计学意义（P＞0.05）。本研究结果表明：加味血府逐瘀汤能明显抑制H22肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长其生存期，对血管内皮生长因子具有抑制作用，值得进一步研究。

［1］Inoshima N，Nakanishi Y，Minami T，et al.The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res，2002，8（11）：3480-3486.

［2］Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis.Semin Oncol，2002，29（6 Suppl 16）：15-18.

［3］Cha C，Dematteo RP.Molecular mechanisms in hepatocellular carcinoma development.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2005，19：25-37.

［4］N.Ferrara，VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat.Rev.Cancer，2002，2：795-803.

（2010-06-06收稿）

Anti-tumor Effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction

Li Yan1，Tian Wei2，Ma Zhonglong3
（1.First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Add.：No.24，Heping Road，Haerbin，Heilongjiang Province，Post code：150040；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine；3.Traditional Chinese Medicine Research and Development Center）

Objective：To investigate anti-tumor effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction and its impact on VEGF.Methods：Adult male mice（n=100），inoculated with H22hepatoma cells，were randomized to 10 groups and administered saline，capecitabine，Modified Xuefu Zhuyu Decoction（high，medium and low dose）.Tumor inhibition rate，life extension rate and the expression of VEGF in tumors were detected on Day11.Results：Tumor inhibition rate of Capecitabine and Modified Xuefu Zhuyu Decoction at high，medium and low dose were 60%，49%，41%，35%，life extension rate：1.68%157.98%，70.58%，49.57%.Conclusion：Modified Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit tumor cell proliferation in tumor bearing mice，significantly prolong the survival time of mice，and reduce expression of VEGF in the tumor tissue.

Modified Xuefu Zhuyu Decoction；H22mice model；Inhibition rate of tumor；Life extension rate