小叶丁香的组织培养
2012-06-02冷强张竹
冷强，张竹
（1.海林市园林管理站，黑龙江 海林 157100；2.大庆医学高等专科学校）
丁香常用的繁殖方法有播种、嫁接和扦插等，但由于播种繁殖发芽率低，嫁接繁殖成活率较低，扦插繁殖的繁殖系数小、周期长，均难以满足市场对种苗的需求。本文旨在探讨通过植物组织培养方法获得小叶丁香的种苗以供园林绿化使用，也为同种植物的组织培养提供一定的理论和实践依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
取小叶丁香的茎段、叶片为外植体进行组织培养，小叶丁香母株取于牡丹江师范学院植物园。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的灭菌
取小叶丁香的茎和叶片流水冲洗1h，在0.1%升汞中灭菌30s、1min、2min，或在65%次氯酸钠中灭菌1min、2min、3min，灭菌后将小叶丁香的茎（带腋芽部分）剪成1～2cm的段状插入不同的培养基中，将叶片剪成（1×1）cm2大小，平放于不同的脱分化 MS培养基中培养。
1.2.2 外植体的脱分化培养
小叶丁香的叶片消毒后，用无菌水冲洗5～6次，无菌吸水纸吸干表面水分，切成（1×1）cm2，分别接入以下培养基中，每种培养基接外植体50个。
A：MS＋6－BA4mg／L＋NAA2mg／L
B：MS＋6－BA3mg／L＋NAA2mg／L
C：MS＋6－BA2.5mg／L＋NAA2mg／L
D：MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L
E：MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA2mg／L
F：MS＋6－BA1mg／L＋NAA2mg／L
G：MS＋6－BA0.5mg／L＋NAA2mg／L
1.2.3 小叶丁香腋芽的促生
取小叶丁香的茎段在65%的次氯酸钠中浸泡2min灭菌之后，用无菌水冲洗5～6次，然后用无菌吸水纸吸干表面水分，切成1～2cm的茎段然后分别接入含有不同浓度6－BA的 MS培养基中（具体浓度见表4），并定时观察。
1.2.4 生根培养
在无菌实验台上将上一步小叶丁香茎段所促生出的腋芽切下，分别接入含有不同浓度NAA的MS培养基中进行生根培养（具体浓度见表5），并定时观察。
1.2.5 培养条件
光培养25℃﹑6000 lx、14h光照／10h黑暗。
2 结果与分析
2.1 不同消毒液及不同消毒时间对小叶丁香外植体的影响
为筛选出最佳的灭菌方法，我们采用不同灭菌剂及不同灭菌时间对小叶丁香外植体进行灭菌。试验结果表明：茎和叶片在0.1%的升汞中灭菌30s时其生长情况最佳，长菌率为0，灭菌1min和2min时，虽然长菌率也为0，但是会引起外植体的死亡；茎在65%的次氯酸钠中灭菌2min时，外植体的灭菌效果最好，叶片在次氯酸钠中的最佳灭菌时间为1min。因为升汞对外植体的毒害情况比次氯酸钠更严重（见表1、表2），因此茎段的最佳灭菌条件为次氯酸钠灭菌2min，叶片最佳灭菌条件为次氯酸钠灭菌1min。
表1 以0.1%升汞为消毒液对小叶丁香外植体最佳消毒时间的筛选
表2 以65%的次氯酸钠为消毒液对小叶丁香外植体最佳消毒时间的筛选
2.2 最佳脱分化培养基的筛选
取小叶丁香的叶片在65%次氯酸钠中灭菌1min，无菌水冲洗5～6次，然后用无菌吸水纸吸干表面水分，切成（1×1）cm2大小，分别接入不同的脱分化培养基中培养，每种培养基接种30片。试验结果表明：随着6－BA的浓度递减，脱分化率有先增加后减少的趋势，其中A、F、G号培养基中，外植体均没有脱分化，说明6－BA浓度过高或过低都会影响外植体的脱分化；在D号培养基中 （MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L）外植体的脱分化率最高为13.3%。总体来看外植体的脱分化率较低，而且出现了褐化现象。褐化现象受很多因素的影响，例如：外植体的基因型、生理状态、大小、种类，光照等等［1－2］。由表3可见，不同的激素浓度对外植体褐化的影响程度不同，其中A、F、G号培养基上外植体褐化最严重，全部外植体均发生褐化。
表3 培养基对小叶丁香叶片脱分化的影响
2.3 小叶丁香茎段最佳腋芽促生培养基的筛选
取小叶丁香的茎在65%的次氯酸钠中浸泡2min灭菌后，用无菌水冲洗5～6次，然后用无菌吸水纸吸干表面水分，切成带腋芽的约1～2cm长的茎段，分别接入以下培养基中培养，试验结果表明：随着6－BA浓度的增加，不仅促生的腋芽数有所增加而且促生腋芽的时间有所缩短，说明6－BA有诱导促生腋芽的良好作用，但这一浓度高于2mg／L时出现下降趋势，确定以茎段促生腋芽的最适培养基为MS＋6－BA2mg／L。
表4 不同培养基对茎段生腋芽的影响
2.4 最适生根培养基的筛选
在超净工作台上将由小叶丁香茎段促生得到腋芽切下，接入含有不同浓度NAA的MS培养基中进行生根培养，并定时观察。试验结果如下：随着NAA浓度的增加，腋芽生根率增加而且发根时间缩短，说明NAA的确有诱导生根的良好作用，当NAA浓度高于0.5mg／L时，生根率呈现下降趋势。试验确定腋芽生根最适培养基为 MS＋NAA0.5mg／L。
表5 不同浓度NAA的MS培养基对腋芽生根的影响
3 结论
3.1 试验结果表明：茎段在0.1%的升汞中浸泡30s后生长情况最佳，长菌率为0%如果时间太长会发生组织的损伤从而引起褐化，而在65%的次氯酸钠中浸泡2min其灭菌最彻底；叶片在0.1%的升汞中浸泡30s后生长情况最佳，在65%的次氯酸钠中浸泡1min生长情况最佳；由于升汞对外植体的毒害比次氯酸钠更严重，所以我们在对外植体灭菌时一般使用次氯酸钠；
3.2 小叶丁香叶片脱分化最佳培养基为 MS＋NAA2mg／L＋6－BA2mg／L；
3.3 小叶丁香茎段生腋芽最佳培养基为 MS＋6－BA2mg／L；
3.4 小叶丁香腋芽生根最佳培养基为MS＋NAA 0.5 mg／L。
图1 小叶丁香叶片愈伤组织的发生情况图
图2 小叶丁香腋芽的生根情况
［1］曾镭，刘燕.植物组织培养中褐化问题的研究进展［J］.安徽农学通报，2007，13（14）：49－50.
［2］王栋，买合木提·克衣木，玉永雄，等.植物组织培养中的褐化现象及其防止措施［J］.黑龙江农业科学，2008（1）：7－10.
