黑龙江省两种金丝桃属植物RAPD反应的初步研究

2012-06-02孟令锴李洁高长久

中国林副特产 2012年1期

孟令锴，李洁，高长久

（1.牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011 2.牡丹江医学院红旗医院）

金丝桃属（HypericumL.）为藤黄科（Clusiaceae）。该属全世界约有400余种，我国有55种，8亚种。该属植物的一些种在国内外广为药用，主要用于治疗抑郁症、肝炎、痢疾，有抗菌消炎、镇痛、收敛等功效。传统中医药学认为其具有清热解毒、收敛止血、利湿之功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、风湿骨痛、口鼻生疮等症［7］。国内外对该属植物的研究极为重视。黑龙江省分布的乌腺金丝桃（H.attenuatumChoisy.）和长柱金丝桃（H.ascyronL.）的研究较少，主要集中在原植物形态、生药性状、显微特征及部分化学成分含量的测定及分析等传统生药学领域。

在目前生药学研究中，主要应用形态学、组织学、化学等物种特异性遗传标记特征，这些特征特别是以形态学为基础的鉴别方法虽然有着简便、易行等优点，然而有很多特征为生物体的遗传物质与外界环境及其他多种因素共同作用的结果，他们在受遗传因素影响的同时，也受到如土壤、气候、阳光等因素的影响，而DNA作为遗传物质，他保持着遗传特性，不受外界因素影响，用DNA遗传物质进行物种鉴定，具有准确性和可靠性。为此，本研究对金丝桃属两种药用植物进行RAPD反应的初步研究，旨在为黑龙江省金丝桃属植物RAPD的有效鉴定奠定基础

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

取供试材料植株新鲜嫩叶片经硅胶干燥保存。乌腺金丝桃：2011年7月采于黑龙江省牡丹江镜泊湖地区。长柱金丝桃：2011年7月采于黑龙江省横道河地区；PCR 扩增仪，Thermo Electron Corporation；YLN－2000凝胶成像分析系统，北京亚力恩机电技术研究所；DYY－8B电泳仪，北京六一仪器厂；DU－800核酸蛋白质分析仪，美国BECKMAN公司。

1.2 试剂

随机引物（primer）、DGL2000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、d NTPs、10×buffer、mgcl2、琼脂糖均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取

采用北京鼎国生物工程技术服务有限公司生产的植物基因组DNA抽提试剂盒提取。

操作步骤：

第1步：组织≤0.5g，液氮研磨，加入1m L溶液B，反复摇均，室温5min。

第2步：加入2.5 m L溶液C，20μL溶液 A，充分摇均，室温放置20min。

第3步：≥8000rpm离心3 min。

第4步：取上清，加入50μL溶液D，≥8000rpm离心1 min，弃上清。

第5步：加入80μL溶液C，摇均，≥8000rpm离心5 min，弃上清。

第6步：加入1m L溶液E，摇均，≥8000rpm离心30～60s，弃上清。

第7步：重复步骤6。

第8步：≥12000rpm离心30～60s，吸干上清，室温敞开晾干约5～10min。

第9步：取250μL溶液F，摇均，40～50℃水浴3～5 min。

第10步：≥12000rpm离心30～60s，取上清，即为DNA。

1.3.2 供试材料基因组DNA检测

供试材料基因组DNA质量检测在DU－800核酸蛋白质分析仪上进行。取1μL的DNA溶液和99μL的TE Buffer于石英比色皿中，混匀，以TE Buffer为对照液，测定波长260nm、280nm的OD260、OD280值，计算OD260／OD280的比值以得样品的纯度，并按总DNA含量（μg／m L）＝ OD260×50×100，计算各样品DNA的浓度。

1.3.3 RAPD反应

反应总体积25μL。依次加超纯水，1μmol／L引物，10 倍 PCR 缓冲液（10mmol／L Tris，p H9.2），25mmol／L KCl，1.5mmol／L MgCl2，0.2mmol／L d NTPs，40ng左右模板DNA，1UTaq酶。

扩增程序：

①193℃，2min。

②293℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸反应1.5min，45个循环。

③72℃，保温5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。

1.3.4 随机引物的筛选

从样本中选出具有代表性的且总DNA质量相对较好的样品作为代表，利用上文中得到的反应条件进行PCR扩增，在30个随机引物中（10bp）进行筛选，选择具有稳定的、能扩增出具有多态性带的有效引物。

1.3.5 PCR产物鉴定与记录

PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（在1×TAE中）分离与鉴定，在紫外透射仪上观察与照相，以DGL2000为DNA分子量标准。

2 结果

2.1 供试材料总DNA的质量

DNA 质量在 DU－800 上测定 OD260、OD280及OD260／OD280值及浓度。见表1。

表1 供试材料基因组DNA的紫外分析结果

2.2 引物筛选结果

图1 部分引物筛选结果

2.3 供试材料基因组的部分指纹图谱

图2 乌腺金丝桃、长柱金丝桃RAPD指纹图谱

由扩增图谱可知：S75、S76、S80引物对乌腺金丝桃及长柱金丝桃基因组DNA扩增，图谱表明两种植物均在200bp左右有相同长度条带，同时也有不同的条带出现，说明其在遗传上既具有相似性，又存在差异，根据这些差异可以有效鉴别金丝桃属两种近缘植物乌腺金丝桃及长柱金丝桃。如应用S75乌腺金丝桃在2000 bp左右有一DNA谱带出现，而长柱金丝桃此条带缺失，该条带的有无可以有效鉴别这两种近缘植物。