王晓君，陈维毅，李晓娜，冯鹏飞，高志鹏

（太原理工大学a.力学学院；b.应用力学与生物医学工程研究所，太原030024）

力学环境是生命体内的一种自然生存环境，也是一个非常复杂的环境，目前对细胞力学的研究大都是通过体外模拟实验来完成的。应力刺激是细胞代谢的重要调节因子，在调节细胞多种生理功能如基因表达、蛋白质合成、细胞增殖、分化等过程中发挥着重要作用［1－2］。应力刺激的大小、频率、时间及加载形式等对细胞功能的影响不同。周期性的应力刺激比持续性的应力刺激更能促进细胞增殖和基因表达［3］。

角膜成纤维细胞位于基质板层中，胞浆中富含内质网和高尔基体。胚胎时期是由颅神经嵴细胞迁移衍生形成的间充质细胞，在迁移完成后，胚胎角膜基质细胞开始合成和分泌Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ型胶原纤维等细胞外基质成分［4］。胶原是细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）中最丰富的结构成分，也是角膜中承受力的主要部分。正常状态下，角膜基质细胞可合成分泌 MMPs，同时也分泌 TIMPs及 TGF-β1。MMPs是一种重要的胶原降解酶，几乎能降解ECM 的所有成分［5－6］，MMPs表达增高，可引起胶原的降解增多。TIMPs在多个环节抑制MMPs的活性，亦有可抑制新生血管形成的作用，二者保持动态平衡，调节 ECM 的稳定［7－8］。MMP-2和 TIMP-2的表达受激素、生长因子、细胞因子、原癌基因等的调控，在这些因子中TGF－β1是被广泛关注并研究的一个［9］。受到力学刺激或创伤后，角膜经历了ECM的合成、降解、再合成的动态修复过程。MMPs与TIMPs的平衡和相互影响决定着ECM的降解，在眼部的伤口愈合、血管生成增殖性病变及组织纤维化等许多病理过程中起重要作用［10－12］。TGF-βl是一个具有多功能的双重调节剂生长因子，其主要的生物学功能之一就是促进ECM表达和抑制ECM的降解。而这一效应又主要是通过调节MMP-2和 TIMP-2的表达来实现的［13］。

角膜基质成纤维细胞主要分泌MMP-2，MMP-2具有监督正常角膜功能的作用，催化降解偶尔受损的角膜胶原，角膜受损后该酶主要参与角膜基质胶原的重建过程，以便恢复角膜组织功能［14］。本文对正常兔角膜成纤维细胞进行幅度分别为5%、10%及15%的周期性机械拉伸，并于拉伸后6h、24 h取细胞培养液，离心取上清，采用ELISA检测MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的含量，研究力学刺激对角膜成纤维细胞外基质中 MMP-2、TIMP-2及TGF-β1表达的影响，探讨力学因素在LASIK术后角膜修复中的作用。

1 方法和材料

1.1 兔角膜成纤维细胞的提取及培养

本实验采用酶消化法培养兔角膜成纤维细胞。正常兔角膜基质中成纤维细胞数量较少，并且呈散在、静止状态。为了获得足够的兔角膜成纤维细胞，一次选取成年3只新西兰大白兔的6个角膜进行原代培养，同时取材时沿角巩膜缘内1mm剪取角膜组织，并在显微镜下彻底清除上皮层和内皮层，以确保原代细胞培养的单一性。

将消化培养法获得的兔角膜细胞接种于培养瓶内培养，约2d后，即可见成纤维细胞开始贴壁生长，1周左右汇合。倒置相差显微镜下观察，可见兔角膜成纤维细胞呈梭形，单层、涡旋状生长。细胞传代爬片后，采用波形蛋白（武汉博士德）对角膜成纤维细胞进行免疫化学染色鉴定，证实本实验提取的细胞为角膜成纤维细胞［2］。

1.2 兔角膜成纤维细胞周期性拉伸实验

Flexcell4000柔性基底拉伸加载系统装置属于张应力系统加力装置，可对群体细胞施加不同力学刺激参数的加载程序。该系统用真空泵对培养的细胞施加动态循环负压，使BioFlex培养板基底膜变形，从而使生长在膜上的贴壁细胞也发生相应的变形，诱发细胞发生生物学变化。加载过程在二氧化碳培养箱内进行。

采用本实验室提取的培养至2－3代的角膜成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105接种于裱衬有I型胶原蛋白的BioFlex六孔培养板上，置于孵箱内培养48h。待细胞80%融合时，换成含2%的胎牛血清，选择加载参数，进行力学加载实验。本实验采用频率为0.1Hz的正弦波分别对兔角膜成纤维细胞实施不同拉伸幅度及加载时间的力学刺激。

加载程式1：牵拉幅度5%；加载时间6h、24h。

加载程式2：牵拉幅度10%；加载时间6h、24h。

加载程式3：牵拉幅度15%；加载时间6h、24h。

每个加载程式均设1组静态对照，细胞代数、培养条件和接种密度与加载组完全相同。拉伸后对细胞进行台盼蓝染色，细胞活性在95%以上。卸载后分别收集每孔的培养液，4℃、3 000r／min离心20 min后取上清。－20℃保存，避免反复冻融。

1.3 ELISA检测

采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测不同拉伸幅度、周期性拉伸不同时间后细胞培养液中MMP-2、TIMP-2 及 TGF－β1 的含量。主要试剂有：兔 MMP-2ELISA 试 剂 盒 （RapidBio Lab，USA），兔 TIMP-2ELISA 试剂盒（RapidBio Lab，USA），TGF-β1ELISA 试 剂 盒 （RapidBio Lab，USA），MMP-2 一 抗 （武 汉博 士 德 进 口 分 装），TIMP-2一抗（武汉博士德进口分装）及TGF－β1一抗（武汉博士德进口分装）。操作步骤严格按说明书进行。采用ELX800酶标仪（Bio-Tek，USA）于450 nm处读取OD值，通过标准曲线获得待测样本MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的浓度。

1.4 统计分析

实验数据均以平均值±标准偏差（x±SD）表示，并采用SPSS14.0统计学软件中的单因素方差分析对数据进行处理，认为p＜0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 周期性机械拉伸对MMP-2表达的影响

拉伸后角膜成纤维细胞MMP-2表达结果如表1所示。

表1 不同拉伸幅度、不同拉伸时间下MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1的含量

当拉伸幅度为5%时，MMP-2的表达同对照组相比，无论拉伸6h还是24h，均无统计学差异（p＞0.05）。当拉伸幅度为10%和15%时，拉伸6h同对照组相比无统计学差异（p＞0.05），而拉伸24h同对照组相比显著性升高（p＜0.05）。

为了观察相同拉伸时间时不同拉伸幅度对MMP-2的表达的影响，分别将不同拉伸幅度的对照组看作1，计算拉伸6h、24h后 MMP-2表达的相对改变量，如图1所示。无论是拉伸6h还是24h，MMP-2的相对含量随拉伸幅度的增大而增加，拉伸24h后，增加幅度更加明显。

图1 不同拉伸幅度、不同拉伸时间对MMP－2表达的影响（＊拉伸组与自身对照组相比，p＜0.05）

2.2 周期性机械拉伸对TIMP-2表达的影响

周期性拉伸后角膜成纤维细胞TIMP-2表达结果见表1。当拉伸幅度为5%和10%时，无论周期性拉伸6h还是24h，TIMP-2的表达同对照组相比均无统计学差异（p＞0.05）。当拉伸幅度为15%时，周期性拉伸6h同对照组相比仍然无统计学差异（p＞0.05），而拉伸24h同对照组相比显著下降（p＜0.05）。

图2 不同拉伸幅度、不同拉伸时间对TIMP-2表达的影响（＊拉伸组与自身对照组相比，p＜0.05）

同样，为了观察相同拉伸时间、不同拉伸幅度对TIMP-2的表达的影响，也进行归一化处理，分别计算周期性拉伸6h、24h后TIMP-2表达的相对改变量，对照比较见图2。拉伸6h后，TIMP-2的相对含量同对照组相比均有所降低，24h后TIMP-2的相对含量随拉伸幅度的增大而降低。

2.3 周期性机械拉伸对TGF-β1表达的影响

拉伸后角膜成纤维细胞TGF－β1表达结果见表1。当拉伸幅度为5%和10%时，无论周期性拉伸6 h还是24h，TGF-β1表达同对照组相比均无统计学差异（p＞0.05）。当拉伸幅度为15%时，拉伸6h同对照组相比无统计学差异（p＞0.05），而拉伸24 h同对照组相比显著性升高（p＜0.05）。

图3为不同拉伸幅度、不同拉伸时间对TGF－β1表达的影响。

同样，为了观察相同拉伸时间、不同拉伸幅度对TGF-β1的表达的影响，也进行归一化处理，分别计算周期性拉伸6h、24h后TGF－β1表达的相对改变量，对照比较见图3。拉伸24h后，拉伸幅度为15%时，TGF-β1的相对含量增加。

图3 不同拉伸幅度、不同拉伸时间对TGF-β1表达的影响（＊拉伸组与自身对照组相比，p＜0.05）

3 讨论

准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis，LASIK）是目前开展广泛且临床疗效明确的治疗近视的角膜屈光手术，但是近年来临床上术后继发性圆锥角膜的病例也屡有报道［15－16］。力学环境的改变对LASIK术后圆锥角膜病变的发展是一个不可忽视的因素，术后角膜层变薄，角膜拮抗膨胀压的能力也随之降低，使受损部位的组织受到更大的牵拉。角膜组织中的角膜成纤维细胞能够感受外来机械应力刺激，并对此作出响应，从而影响其生长、增殖、凋亡及其分泌的胶原等细胞外基质成分。

正常角膜中MMP多以无活性的酶原形式存在。当受到力学、化学及各种病理浸润后，MMP被激活，基质降解增加、组织破坏；同时ECM成分合成增加，对角膜进行修复。如果MMP的活化调节失控，角膜即发生溶解溃疡或瘢痕形成。LASIK术后角膜上皮受损，基质细胞发生增殖，分泌MMPs，使基质细胞从静止状态转变为激活状态，并进行基质重塑［17］。角膜受损后出现的炎性反应，能引起角膜基质的分解酶活性增加，导致角膜融解、变薄，从而导致继发性圆锥角膜［18］。LASIK术在改变角膜在体内力学环境的同时，也使角膜受到不同程度的损伤，很难界定哪些改变是由单纯力学环境改变而引起的。

研究表明，体外力学因素能够影响 MMP-2、TIMP-2及TGF－β1的表达。过度拉伸可以直接上调肌腱成纤维细胞MMP-2的表达和活性，而对其抑制剂TIMP-2却没有显著影响［19］。对牛小梁细胞周期性拉伸72h后，与对照组相比 MMP-2与TIMP-1含量明显增加，而 TIMP-2和 MMP-9的水平不受影响［20］。对人巩膜成纤维细胞进行拉伸幅度为15%的48h周期性拉伸后，巩膜成纤维细胞分泌的ProMMP-2表达显著增加，TIMP-2表达显著降低，从而增加了MMP-2的活性，有助于降解巩膜细胞外基质，使眼巩膜变薄进而导致眼球膨胀［3］。TGF-β1含量增高，可导致 MMP-2的分泌作用增强，如在人绒癌细胞中及在人腹膜间皮细胞中检测到 TGF－β1能刺激 MMP-2表达增强［13］。

本文结果表明，15%幅度的周期性拉伸24h后，角膜成纤维细胞分泌TIMP-2减少，对 MMP－2抑制作用减弱，同时TGF－β1表达增高，刺激 MMP－2表达升高，这均与 MMP-2表达的变化具有一致性。说明角膜成纤维细胞在体外以一定幅度周期性拉伸一定时间后，细胞分泌的 MMP-2、TIMP-2及TGF-β1才会发生显著改变，三者相互作用，共同调节角膜成纤维细胞的生物学行为。这提示在一定强度的力学刺激下，角膜细胞外基质胶原酶的数量或活性增高，胶原酶抑制剂的水平降低均可使细胞外胶原成分及代谢发生变化。因此，建立不同切削量的LASIK术动物模型，检测术后不同时期角膜组织中MMP-2、TIMP-2的含量及角膜组织力学性能的改变，从生物力学角度探讨手术引起的继发性圆锥角膜的成因十分必要。

体外力学拉伸虽然可以直接阐明力学刺激对MMP-2、TIMP-2及 TGF－β1表达的影响，但在角膜生理、病理和手术过程中，损伤导致的炎性因子和细胞因子的释放，会对 MMP-2、TIMP-2及TGF－β1表达产生影响，并可能与力学刺激产生协同效应。角膜细胞、细胞外基质以及各种调节因子之间存在着复杂而精确的网络调控，以适应角膜发育、组织塑型、损伤修复等动态平衡的需要，目前这类复杂的调控机制还不明了，尚待进一步研究。

［1］ Nagayama K，Nagano Y，Sato M，et al.Effect of actin filament distribution on tensile properties of smooth muscle cells obtained from rat thoracic aortas［J］.J Biomech，2006，39（2）：293-301.

［2］ 李晓娜，王晓君，贺瑞，等.力学刺激对角膜成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子表达的影响［J］.医用生物力学，2012，27（1）：72-76.

［3］ Shelton L，Rada J.Effects of cyclic mechanical stretch on extracellular matrix synthesis by human scleral fibroblasts［J］.Exp Eye Res，2007，84（2）：314-322.

［4］ 朱梅红，韩晓丽，徐国兴.角膜基质细胞研究进展［J］.国际眼科纵览，2007，31（6）：389-391.

［5］ Sivak J，Fini M.MMPs in the eye：emerging roles for matrix metalloproteinases in ocular physiology［J］.Progress in Retinal and Eye Research，2002，21（1）：1-14.

［6］ Ye H，Azar D.Expression of gelatinases A and B，and TIMPs 1and 2during corneal wound healing［J］.Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science，1998，39（6）：913.

［7］ Huppertz B，Kertschanska S，Demir AY.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases（MMP），their substrates，and their inhibitors（TIMP）during trophoblast invasion in the human placenta［J］.Cell Tissue Res，1998，291（1）：133-148.

［8］ Matsubara M，Girard M，Kublin C，et al.Differential roles for two gelatinolytic enzymes of the matrix metalloproteinase family in the remodelling cornea［J］.Developmental Biology，1991，147（2）：425-439.

［9］ Pasquale L，Dorman-Pease M，Lutty G，et al.Immunolocalization ofTGF-Beta 1，TGF-beta 2，and TGF-beta 3in the anterior segment of the human eye［J］.Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science，1993，34（1）：23.

［10］ Kristyna Brejchova，Petra Liskova，Jitka Cejkova，et al.Role of matrix metalloproteinases in recurrent corneal melting［J］.Exp Eye Res，2010，90：583-590.

［11］ 李永明，唐林，张晓东等.牵张应力对人牙周膜细胞MMP-13／TIMP-1表达的影响及其信号转导途径研究［J］.医用生物力学，2010，6：34-39.

［12］ 陈文琦，王业全，杨力.前交叉韧带损伤对 MMP-2，-9活性以及氧分压影响的研究［J］.医用生物力学，2009（s1）：131-132.

［13］ Martin J，Yung S，Robson R，et al.Production and regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors by human peritoneal mesothelial cells［J］.Peritoneal Dialysis International，2000，20（5）：524.

［14］ Smith V A，Matthews F J，Majid M A.Keratoconus：matrix metalloproteinase-2activation and TIMP modulation［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1762（4）：431-439.

［15］ Seiler T，Koufala K，Richter G.Iatrogenic keratectasia after laser in situ keratomileusis［J］.J Refract Surg，1998，14（3）：312-317.

［16］ Rad AS，Jabbarvand M，Saifi N.Progressive keratectasia after laser in situ keratomileusis［J］.J Refract Surg，2004，20（5 Suppl）：S718-722.

［17］ West-Mays J，Dwivedi D.The keratocyte：corneal stromal cell with variable repair phenotypes［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell biology，2006，38（10）：1625-1631.

［18］ Comaish I F，Lawless M A.Progressive post-LASIK keratectasia：biomechanical instability or chronic disease process［J］.J Cataract Refract Surg，2002，28（12）：2206-2213.

［19］ 董科，杨文贤，窦海波.过度拉伸对大鼠跟腱成纤维细胞中基质金属蛋白酶-2表达的影响［J］.北京体育大学学报，2009，2（9）：59-61.

［20］ Yumiko O，Toshihiko M，Hiroshi O，Ovine trabecular cells produce TIMP-1and MMP-2in response to mechanical stretching［J］.Jpn J Ophthalmol，1998，42：90-94.