白生军，马晖玲，马 祥，安惠惠

（甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070）

草地早熟禾（Poa pratensis）是禾本科早熟禾属一种优质冷季型草坪草。草地早熟禾抗寒性较差［1］，植物生殖方式复杂多样，常以兼性无融合生殖方式进行繁殖［2－6］，有些品种无融合生殖率高达98%以上［3，6］，有性杂交率低，很难获得杂种优势品种。以原生质体培养为基础和前提条件的体细胞杂交技术不失为选育草地早熟禾杂种细胞可行而有效的育种途径之一。Vander等［7］开创了草地早熟禾原生质体培养的先河，Kisten等［8］的研究进一步奠定草地早熟禾原生质体培养的基础，但目前来看，早熟禾体细胞杂交技术还不成熟，研究相对不够深入，仅获得一些阶段性成果［9，10］。

实验以草地早熟禾午夜2号（MidnightⅡ）、新格莱德（Nuglade）和橄榄球2号（RugbyⅡ）3个品种的优质愈伤组织为材料，研究不同培养方式和pH对原生质体分裂和生长的影响，探索不同品种原生质体的最佳培养方式，以期为进一步完善草地早熟禾的原生质体培养奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

将3个草地早熟禾午夜2号、新格莱德和橄榄球2号品种的成熟种子接种于添加各品种诱导愈伤组织适宜浓度激素的 MS培养基上（午夜2号：1mg/L 2，4－D＋0.3mg/L 6－BA；新格莱德：3mg/L 2，4－D＋0.5 mg/L 6－BA；橄榄球2号：3mg/L 2，4－D＋0.1mg/L 6－BA；），诱导并优化培养得到生长状态质地良好的愈伤组织。

1.2 实验方法

挑选各品种继代20次生长状态良好的愈伤组织1g，置10mL酶液（13%甘露醇CPW＋1%的纤维素酶＋1%的离析酶＋0.3%的崩溃酶＋0.3%的果胶酶和5mol/L的 MES，pH 5.8），25±1℃，50r/min摇床暗中酶解16h。……