黄雄昂，叶祥明，林坚，刘晓林，李琳

超短波对大鼠脑缺血再灌注后肿瘤坏死因子-α和Bcl-2表达的影响①

黄雄昂，叶祥明，林坚，刘晓林，李琳

目的观察超短波对脑缺血再灌注后大鼠海马、纹状体和运动皮质内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Bcl-2蛋白表达的影响。方法 应用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，分为假手术组、造模组、超短波治疗组，每组6只。脑组织切片行免疫组织化学染色(SABC法)，观察TNF-α和Bcl-2在脑组织中表达的变化。结果造模组大鼠海马、纹状体和运动皮质TNF-α和Bcl-2的表达明显高于假手术组(P＜0.01)；超短波治疗组TNF-α表达低于造模组，Bcl-2表达高于造模组(P＜0.05)。结论超短波治疗通过影响TNF-α和Bcl-2的表达对缺血再灌注脑组织产生一定的保护作用。

脑缺血；缺血再灌注；超短波；肿瘤坏死因子；Bcl-2

[本文著录格式]黄雄昂，叶祥明，林坚，等.超短波对大鼠脑缺血再灌注后肿瘤坏死因子-α和Bcl-2表达的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(5):411-413.

许多研究证明，无热量超短波治疗能改善脑缺血再灌注后血流，减轻脑水肿，提高抗氧化酶含量及降低氧自由基产物[1-4]。本研究探讨急性脑缺血再灌注后无热量超短波对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及细胞凋亡相关基因Bcl-2蛋白表达的影响，为超短波治疗的临床应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 成年健康Sprague-Daw ley(SD)大鼠18只，雌雄不拘，由山东大学动物实验中心提供，体质量220～270 g；浓缩型鼠抗大鼠TNF-α、Bcl-2单克隆抗体和SABC免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将实验动物分为假手术组、造模组、治疗组3组，每组6只。假手术组和造模组术后不做任何处理，治疗组在造模后6 h给予超短波治疗。所有大鼠于术后24 h处死取材。

1.2.2 动物模型制备 应用线栓法建立大脑中动脉闭塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型[5]。动物苏醒后出现左侧霍纳征，提尾右前肢屈曲，或爬行向右侧划圈者为手术成功标志。假手术组除不插尼龙线外，其余步骤相同。3组于术后返回鼠笼喂养。

1.2.3 超短波治疗 采用上海电子仪器厂生产的五官超短波治疗机，频率40.68 MHz，最大输出功率40W，调谐后第1档输出功率约11W。大鼠固定于特制的塑料固定器内，直径4 cm圆形电极对置于大鼠脑两侧，电极与大鼠头部皮肤间隔2 cm，治疗时间10m in。

1.2.4 组织切片制备与免疫组织化学染色 取前囟前2～4mm(运动皮质区和纹状体区)、前囟后3～5mm(海马区)各厚2mm两块冠状组织块置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，冠状连续切片，片厚4μm。每块大鼠脑组织均分别制作1张TNF-α和Bcl-2免疫组化染色切片。免疫组化测定采用SABC法，按照试剂盒说明书进行操作。阴性对照用0.1 mol/L PBS代替一抗。

1.2.5 免疫组化图像采集与分析 采用Leica IM 50图像采集系统对各组免疫组化切片进行图像采集，在各大鼠脑组织切片的海马(CA1～3)区、纹状体区和运动皮质区随机选取6个完整而不重叠的高倍镜视野(400×)采图，其中海马CA 1、CA2、CA 3区的锥体层各取2个视野，应用Image-Pro Plus图像分析软件对每个视野下阳性反应物的平均光密度和阳性面积率进行测定。以每例6个视野的平均光密度和阳性面积率的平均值做为该例相应区域的测量值。

1.3 统计学分析 所有数据采用SPSS 12.0软件进行处理，实验数据以(±s)表示，两样本均数间比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 大体观察 造模组及治疗组大体检查均见患侧大脑半球脑水肿明显，颜色苍白，脑沟脑回模糊不清，组织较脆，呈豆腐渣样。

2.2 免疫组化染色 TNF-α和Bcl-2免疫组化染色阳性物质呈棕黄色颗粒，聚集于神经元胞体及轴突，神经胶质细胞和神经纤维网也可见较多阳性颗粒物沉着。假手术组免疫阳性颗粒染色浅，数量少；造模组和治疗组海马、纹状体及运动皮质神经细胞胞浆可见大量深棕色TNF-α和黄色Bcl-2免疫阳性颗粒，其中运动皮质各层神经细胞均有阳性反应，特别是大锥体细胞和大梭形细胞胞浆呈现大量典型的阳性颗粒物。

2.3 图像分析 与假手术组比较，造模组不同脑区TNF-α和Bcl-2平均光密度与阳性面积率都明显增高(P＜0.01)；治疗组TNF-α各脑区平均光密度和阳性面积率均低于造模组(P＜0.05)，Bcl-2平均光密度均显著高于造模组(P＜0.001)，海马及运动皮质区阳性面积率高于造模组(P＜0.05)。见表1、表2。

3 讨论

目前认为，脑缺血再灌注损伤是多种致病机制共同作用、互相促进的结果，其中脑组织长时间缺血缺氧造成能量代谢紊乱、神经元电活动衰竭、细胞膜去极化、细胞膜离子梯度丧失，进而引起细胞死亡；即使在短时间内完全恢复血供，继发性损伤(如神经元凋亡、自由基生成增多、钙超载、兴奋性氨基酸堆积、炎性细胞浸润等)仍将影响脑组织功能。

表1 各组不同脑区TNF-α和Bcl-2平均光密度

表2 各组不同脑区TNF-α和Bcl-2阳性面积率(%)

TNF-α是机体炎症和免疫应答的重要介质，Vila、W ittmann等发现，TNF-α水平在脑缺血时增高，且与脑缺血程度、神经功能缺损程度、急性脑梗死面积和部位等密切相关[6-7]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，能抑制多种损伤因子激发的细胞凋亡。有研究表明，Bcl-2可调节线粒体通透性，抑制细胞色素C释放和脂质过氧化物的形成，阻止氧化应激反应，加强线粒体摄取钙离子的作用，提高线粒体对钙离子诱导的呼吸链损伤的耐受力，从而抑制细胞凋亡过程[8-9]。

脑梗死的临床治疗强调超早期改善局部脑组织血液供应。超短波能加速血流，扩张血管，改善组织器官血液循环，增加血管壁通透性。

结合以往对缺血再灌注脑血流量时间窗的研究[10]和超短波的作用特性，在再灌注初期(6 h以内)脑血流量突然增加，形成所谓高灌注状态，此时如给予超短波治疗则会进一步增加血流，不仅可能造成出血，而且可促进神经细胞凋亡，加重损伤；而在再灌注6 h以后，血流量降低，形成低灌注状态，这时给予超短波治疗则可缓解低灌注状态，减轻其缺氧缺血，抑制细胞凋亡，对再灌注损伤起保护作用。本实验选择在造模后6 h进行超短波治疗，符合以往研究提示的治疗时机。

目前大多数人认为，超短波对脑缺血再灌注损伤的治疗作用主要与改善局部脑供血状态有关。此外也有文献报道，无热量超短波的非热效应产生的高频振荡，可以使组织中的离子、偶极子、微粒之间的摩擦增加，促使组织各种成分的交换，改变了组织的理化过程，在此作用下出现生长发育迅速、神经纤维再生加速、白血球吞噬作用加强等效果[11]。本研究显示，超短波能减少缺血再灌注大鼠脑中TNF-α的表达，增加Bcl-2的表达，从而减少继发性炎性反应对脑组织的损害，减少神经细胞凋亡发生，有助于脑功能恢复。这一作用机制是否与非热效应有关，还有待进一步研究。超短波疗法对缺血再灌注损伤脑组织有一定的保护作用，在改善脑血流、治疗缺血性脑血管病方面有较好的应用前景。但其作用机制、治疗剂量、最佳治疗时机，以及治疗中的安全保障等诸多方面仍有待进一步研究。

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Effect of U ltrashortW ave Diatherm y on Exp ression of Tum or Necrosis Factor-αand Bcl-2 after Cerebral Ischem ia/Reper fusion in Rats

HUANG Xiong-ang,YE Xiang-m ing,LIN Jian,et al.Department ofRehabilitation Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014,Zhejiang,China

Ob jectiveTo observe the effects of ultrashortwave diathermy on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and Bcl-2 in hippocampus,striatum and motor cortex of ratswith cerebral ischem ia/reperfusion.M ethodsThemodel of focal ischem ia/reperfusion in Sprague-Daw ley ratswas induced with intralum inalm iddle cerebral artery occlusion(MCAO)with nylonmonofilament suture.The ratswere divided into 3 groups:sham group(n=6),model group(n=6)and ultrashortwave diathermy group(n=6).Brain tissue sliceswere immunohistochem ically stained(SABC)to observe the expression of TNF-αand Bcl-2.Resu ltsThe expression of TNF-αand Bcl-2 in left hippocam pus,striatum andmotor cortex was higher in themodelgroup than in the sham group(P＜0.01).The expression of TNF-αwas lower but Bcl-2 was higher in the ultrashortwave diathermy group than in themodel group(P＜0.05).ConclusionU ltrashortwave diathermy can affect the expression of TNF-αand Bcl-2,whichmay associate to the neuroprotection from focal cerebral ischem ia/reperfusion injury.

cerebral ischem ia;ischem ia/reperfusion;ultrashortwave diatherm y;tumor necrosis factor;Bcl-2

R743.3

A

1006-9771(2012)05-0411-03

2012-01-16

2012-04-06)

浙江省人民医院康复医学科，浙江杭州市310014。作者简介：黄雄昂(1978-)，男，浙江遂昌县人，硕士，医师，主要研究方向：神经系统疾病康复。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.004