周礼红 陈平 赵永霞 荆雯雯 李祝 葛永仪

摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ＲＥＭＩ）技术介导的红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素B作为抗性筛选标记，ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１作为转化质粒，采用ＲＥＭＩ技术转化红曲霉。结果表明，用ＲＥＭＩ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ＲＥＭＩ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时，每微克质粒可获得的潮霉素Ｂ抗性转化子为２ ８００～３ ２００个；ＨｉｎｄⅢ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ Ｕ；在质粒用量为８ μｇ／１００ μＬ时转化率最高。

关键词：红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（REMI）

中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4129-05

Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ－Mｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ （ＲＥＭＩ）

ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙｏｎｇ－ｘｉａ，ＪＩＮＧ Ｗｅｎ－ｗｅｎ，ＬＩ Ｚｈｕ，ＧＥ Ｙｏｎｇ－ｙｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）， ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ａｓ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ， ｐＣＢ１００３ ａｎｄ ｐＡＮ７－１ ａｓ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｍ． ａｎｋａ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｙ ＲＥＭＩ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ ａｎｄ ｐＣＢ１００３ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｎｏ ｍａｔｔｅｒ ｉｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｎｏｔ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １×１０７～１×１０８ ｍＬ ｗｅｒｅ ｆｉｔ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｍ． ａｎｋａ， ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ２ ８００～３ ２００ ｉｎｄ．／μｇ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｏｓｅ ｗａｓ １０5～１２０ Ｕ ａｎｄ ８ μｇ／１００ μＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ．； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）

限制性内切酶介导的整合（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＲＥＭＩ）技术是将ＤＮＡ转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种方法。ＲＥＭＩ的非同源整合机理与非同源末端连接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ＤＮＡ的酶随线性化ＤＮＡ进入核内；第二，限制性内切酶在特定识别位点酶切宿主染色体ＤＮＡ；第三，染色体ＤＮＡ和转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。

１９９１年Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ＲＥＭＩ技术应用于极易同源整合的Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。Ｋｕｓｐａ等［７］首先将ＲＥＭＩ技术应用于Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。ＲＥＭＩ技术还成功应用于子囊菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ［１１］、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。

研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。……