董志辉

(辽宁省沈阳市苏家屯区中医医院，辽宁沈阳220101)

1 引言

粉虱传双生病毒(Whitefly transmitted geminivirus，WTG)是一类广泛发生在热带、亚热带地区植物上的具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒。在分类上属双生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。该属的大多数病毒是双组份双生病毒，其基因组为两条长度相似(每条约2.8kb)的闭合环状ssDNA分子，分别为DNA－A和DNA－B。少数病毒为单组分双生病毒，仅有一个DNA－A组分［1］。目前，在亚洲和非洲等许多国家的单组份begomoviruses上发现了伴随有DNAβ的病害复合体。DNAβ对于begomoviruses诱导典型症状是必需的，并可能在决定病毒寄主范围中起重要作用，为病毒适应更多的寄主提供了机会［2～5］。我国自 1982 年报道［6］发现双生病毒以来，在云南、海南、广西、和广东等18省区的番茄、番木瓜、烟草和番薯等已相继发现多种双生病毒［7～11］。双生病毒在我国的危害日益严重，随着全球气候变暖、农业生态环境变化、烟粉虱赖以越冬的地域不断北移以及交通、旅游、农产品贸易全球化等因素，我国双生病毒发生地区不断北移，并给生产上造成较大的损失［12］。本文对从福建漳州稀莶(Siegesbeckia orientalis)上采集到具典型双生病毒症状的样品进行了分子检测，并对序列进行了分析。

2 实验方法

2.1 植物样品

2012年2月，在福建漳州地区采集到表现双生病毒的典型黄脉症状稀莶样品。

2.2 DNA提取及PCR扩增

利用CTAB法提取的稀莶病样总DNA作为模板［13］。利用引物 PA/PB［11］(TAATATTACCKGWKGVCCSC/TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA)扩增双生病毒基因组DNA－A的部分序列，根据测出的序列设计引物FJ12F/R(ACAGAATGTACAAAAGCCCTGA/ATCTGCTGGTCGCTTC GACAT)扩增近全长的DNA－A，扩增的PCR产物克隆至pMD－18T Vector，测序。利用通用引物PCRC1/PBL1V 2040［14］(CTAGCTGCAGCATATTTACRARWATGCC/ACCTCTGCAGCARTGRTCCKATYTTCATAC)扩增双生病毒DNA－B组分。利用通用引物Beta01/02(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCC AGGGGTACAC)［15］扩增双生病毒伴随卫星DNAβ分子。利用通用引物DNA101/102(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGTAC AC)［16］扩增双生病毒伴随卫星DNA1分子。

2.3 序列分析

序列测定由上海生物工程有限公司完成。数据处理借助 DNAStar软件(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和 DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft，Quebe Canad)进行。利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA－A和DNAβ序列最相近的基因组序列。采用DNAStar分析软件(Madison，Wis.，U.S.A)中 ClustalV方法对DNA－A和DNAβ序列的核苷酸或者氨基酸的相似性进行分析。采用Mega4.0临近法绘制亲缘关系树，设置种子重复数是1000［17］。

3 实验结果与分析

3.1 病毒基因组DNA－A的分子特征

FJ12 DNA－A全长2770nts，具有典型的双生病毒基因组结构，即编码6个开放读码框架(ORFs)，其中病毒链编码AV1(CP)和AV2两个ORFs，互补链编码AC1(Rep)、AC2、AC3和 AC4共4个 ORFs。DNA －A 还含有一个较长的非编码区，又称基因间隔区(Intergenic Region，IR)，并含有保守序列TAATATTAC及TATA盒(核苷酸2672－2675位)，还有重复序列GGTGTC(核苷酸2625－2631位，重复于核苷酸2654－2659位和2661－2666位，反方向重复于核苷酸2654－2659位2680－2685)，该重复序列是复制酶蛋白的结合位点。

从全基因组看，相似性与稀莶黄脉病毒的同源性最高，为95.7%，其次与中国番木瓜曲叶病毒PaLCuCNV的相似性较高，为76.8%。而FJ12 IR除了与稀莶黄脉病毒的同源性最高为86.8%外，与其它begomoviruses的相似性都很低，只有39.9% ～58.6%。对编码的蛋白序列进行比较时，FJ12编码的6个基因都与SbYVV的同源性最高，其中 AV1为96.6%，AV2为95.3%，AC1为97.3%，AC2 为 91.2%，AC3 为 94.0%;AC4 为93.8%(表1)。

表1 FJ12DNA－A与其他双生病毒DNA－A核苷酸和氨基酸序列的相似性比较 %

病毒DNA-A IR AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4 TbCSV 72.2 58.6 80.9 62.6 85.0 56.0 69.4 77.3 TbLCJV 70.0 44.8 76.5 66.4 80.6 59.3 71.6 73.2 ToLCGdV 76.2 50.5 95.3 76.7 84.2 60.0 69.4 74.2 ToLCVV 75.9 55.8 95.3 73.3 84.5 56.3 61.2 76.3 TYLCCNV 72.8 54.9 80.1 68.7 83.9 57.5 74.6 78.4 SbYVV 95.7 86.8 97.3 96.6 95.3 91.2 94.0 93.8

为了进一步明确这FJ12分离物与其它病毒的系统亲缘关系，笔者构建了基于DNA－A核苷酸序列的系统关系树(图1A)。从图上可看出，与序列比较的结果相似，FJ12在系统树上与SbYVV聚类在一起，稀莶黄脉病毒进化关系相对其它begomoviruses较近。

根据双生病毒科分类标准，即病毒全基因组核苷酸序列同源性小于89%，往往定名为不同病毒，大于89%，则认为是同一病毒的不同株系［1］。以上分析结果表明:FJ12 DNA－A是稀莶黄脉病毒在福建的一个新的分离物。

3.2 卫星DNAβ分子的分子特征

利用特异性引物beta01/beta02扩增到约1300 bp的片段，经测序后发现是DNAβ分子(FJ12β)。FJ12β全长为1331 nts，具有典型的伴随卫星分子的基因组结构:含有一个保守的ORF，是编码116个氨基酸的βCl基因;含有一个保守的SCR区，并在SCR的3’端具有九核苷酸TAATATT/AC;一个富含腺嘌呤A的区域(A－rich region)，序列的位置在717～979nts，其中A含量达到51.0～52.5%，A的重复数最高为7个。

序列比较分析结果显示，FJ12β与已知的卫星分子的同源性都很低，只有30.6% ～70.2%。其中，FJ12β与 SbYVV DNAβ相似性最高，为70.2%。βCl相似性也与SbYVV DNAβ最高，为92.2%，其余都在25.0% ～44.8%之间。SCR是 DNAβ 分子中最保守的区域，其相似性为74.8% ～97.0%，其中与SbYVV DNAβ最高，为97.0%。这说明稀莶样品中的DNAβ分子确实可以用保守的SCR区作为探针检测到，但它是一类全新的DNAβ分子，伴随于稀莶样品中发现的DNA－A(表2)。

表2 FJ12β与其他DNAβ的全长核苷酸及βC1编码的氨基酸序列相似性比较 %

为了进一步明确这FJ12β与其它卫星分子的系统亲缘关系，构建了基于DNAβ核苷酸序列的系统关系树(图B)。从图上可看出，与序列比较的结果相似，FJ12在系统树上与SbYVV聚类在一起成一个小分支，与稀莶黄脉病毒进化关系相对其它begomoviruses较近。

图1 FJ12DNA－A和其他双生病毒全长核苷酸序列构建的系统关系树(A)FJ12β和其他双生病毒DNAβ全长核苷酸序列构建的系统关系树(B)

根据双生病毒科卫星分子分类标准，即病毒卫星分子全基因组核苷酸序列同源性小于78%，往往定名为不同病毒，大于78%，则认为是同一病毒卫星的不同株系［18］。以上分析结果表明，FJ12 DNAβ是双生病毒伴随卫星的一个新种，建议命名为福建稀莶黄脉病毒伴随卫星分子。

4 结语

(1)FJ12稀莶样品都由双生病毒侵染，该病毒是单组份双生病毒，基因组由一个DNA－A组分(FJ12DNA－A及其伴随卫星DNAβ分子(FJ12DNAβ)组成。不含有 DNA－B和 DNA－1组分;

(2)FJ12 DNA－A全基因组的核苷酸序列与稀莶黄脉病毒的同源性最高，为95.7%。根据双生病毒分类标准，说明FJ12稀莶样品上的双生病毒为稀莶黄脉病毒在福建的一个新的分离物。

(3)FJ12DNAβ分子全基因组的核苷酸序列与稀莶黄脉病毒伴随卫星的同源性最高，为70.2%。根据双生病毒伴随卫星的分类标准，说明FJ12DNAβ是一个新型的卫星分子，我们推荐将其命名为福建稀稀莶黄脉病毒伴随卫星分子。

(4)进化树分析显示，FJ12 DNA－A和FJ12DNAβ都与稀莶黄脉病毒的亲缘关系最近，推测DNA－A在进化过程中捕获了其他植物或病毒的分子后，重组得到新的DNAβ分子。

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