柴 川 白永涛 文红梅 宋利华 涂佳玉 单晨啸

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210029;2.河南省新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453100

淡豆豉是由豆科植物大豆 ［Glycine max(L.)Merr.］的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成的制品，历版《中国药典》均有记载，为常用中药，具有解表，除烦，宣发郁热等功效，可用于感冒、寒热、头痛、烦躁、胸闷及虚烦不眠等症［1］。淡豆豉处方大豆用量最高，大豆异黄酮类为其主要活性成分，具有明显改善心血管功能［2］，降低去卵巢大鼠胆固醇水平和调节血脂的功效［3－4］，缓解由于更年期雌激素不足所引起的骨质疏松［5－6］。淡豆豉中异黄酮分为游离型苷元和结合型糖苷两类，其中苷元比糖苷具有更强的生物活性和更高的生物利用度。淡豆豉中异黄酮测定方法以高效液相色谱 (HPLC)法最多［7－9］。本文建立了快速测定淡豆豉中大豆苷元 (Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)、染料木素 (Genistein)3种主要异黄酮苷元成分的超高效液相色谱法 (UPLC法)，与HPLC法相比，分析时间短，分析效率高，重现性好等特点，可以更好地用于淡豆豉药材的质量评价。

1 仪器与试药

仪器 Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪:包括在线真空脱气系统，四元超高压泵系统，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，Empower 2工作站。KQ－500DE型医用数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);Startorius BP211D电子天平 (德国Startorius公司)。

对照品 大豆苷元、黄豆黄素、染料木素均购于南京泽朗医药科技有限公司 (经UPLC分析纯度均在98%以上)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

淡豆豉购于南京市药材公司，经南京中医药大学药学院王春根教授鉴定为由豆科植物大豆 ［Glycine max(L.)Merr.］的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成的淡豆豉制品，批号:090810、090927、091025，产地为河南。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Acquity BEH C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.7μm);流动相为乙腈－0.1%甲酸水溶液(24:76);检测波长:260nm;进样量:1μL;柱温:40℃;流速:0.4mL·min－1;样品室温度:4℃。混合对照品和淡豆豉样品的色谱图见图1，淡豆豉样品中3种异黄酮苷元成分均达到基线分离。

图1 大豆苷元、黄豆黄素、染料木素对照品色谱图 (A)及淡豆豉样品色谱图 (B)

2.2 对照品溶液的制备

分别称取大豆苷元、黄豆黄素及染料木素对照品适量，分别置于100mL量瓶中，加80%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为110.7、62.6、105.5μg·mL－1对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取淡豆豉药材粉末2g(过80目筛)，精密称定，置于50mL锥形瓶中，加80%甲醇20mL，超声提取2次，每次30min，滤过，用80%甲醇洗涤滤渣，置50mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取大豆苷元、黄豆黄素、染料木素对照品贮备液各1mL，置于10mL量瓶中，并用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液;再依次逐级稀释制成大豆苷元、黄豆黄素、染料木素浓度为 (11.07、6.26、10.55)、(5.535、3.13、5275)、(2.214、1.252、2.120)、(1.107、0.626、1.055)、 (0.5535、0.313、0.5275)、 (0.2214、0.1252、0.212)的溶液，分别进样1μL，以对照品的浓度X(μg·mL－1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程见表1。

表1 3种大豆异黄酮苷元的线性回归方程和线性范围

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液 (大豆苷元2.214μg·mL－1黄豆黄素1.252μg·mL－1染料木素2.120μg·mL－1)，按照上述的色谱条件连续进样6次，以色谱峰面积计算，大豆苷元，黄豆黄素，染料木素的 RSD分别为0.52%，0.62%，0.71%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h进样，测得峰面积，计算得大豆苷元，黄豆黄素，染料木素峰面积的RSD分别为0.49% ，1.34% ，0.67% 。表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批淡豆豉药材样品 (090927)2g，共6份，精密称定，按照2.3项下方法制备供试品溶液并测定，计算待测成分平均含量 (RSD%)，分别为大豆苷元137.7μg·g－1(1.34%)，黄豆黄素 29.69μg·g－1(2.83%)，染料木素128.8μg·g－1(2.05%)，表明本方法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取已测知含量的样品 (090927)约2.0 g，共9份，分为3组，分别精密加入大豆苷元贮备液 (110.7μg·mL－1)2.0、2.5、3.0mL，黄豆黄素贮备液 (62.6μg·mL－1)0.75、1.0、1.25mL及染料木素贮备液 (105.5μg·mL－1)2.0、2.5、3.0mL，按照2.3项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件测定，分别计算回收率。其平均回收率及 RSD值分别为 100.5% (3.87%)、99.06%(2.26%)、97.84%(1.60%)。

2.9 样品测定

取不同批次的淡豆豉样品粉末2g，精密称定，各3份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算3种异黄酮苷元的含量，结果见表2。

表2 淡豆豉药材中大豆苷元，黄豆黄素，染料木素的测定结果(X/μg·g－1± SD)

3 讨论

3.1 色谱条件选择 分别比较了甲醇－水、乙腈－水体系和甲醇－甲酸水、乙腈－甲酸水体系，甲醇－水、乙腈－水体系中异黄酮色谱峰形稍显拖尾，而甲醇－甲酸水，乙腈－甲酸水体系中色谱峰形对称。经优化选择乙腈－0.1%甲酸水 (24:76)为流动相，在此色谱条件下3种异黄酮成分色谱峰均达到基线分离，峰形对称，大豆苷元、黄豆黄毒、染料木素的保留时间分别为2.35、2.72、4.50min，样品分析时间为5min。本文建立的UPLC测定淡豆豉中异黄酮苷元的方法与普通HPLC法［7－9］比较，分析速度提高了5～8倍，同时也具有良好的准确度、精密度和耐用性。3.2 供试品制备方法的选择 选择简便的超声处理(250W，50KHz)方式提取淡豆豉中异黄酮苷，对提取溶剂(40%甲醇，80%甲醇、甲醇)、提取次数 (1、2、3次)进行考察，以80%甲醇超声处理2次，可将淡豆豉中异黄酮苷元提取完全。

4 结论

淡豆豉中大豆异黄酮的含量测定，文献报道中主要对大豆苷元 (大豆黄素)和染料木素进行测定，本文建立的同时测定大豆苷元、黄豆黄素和染料木素3种异黄酮类成分的快速测定方法，为更好地评价和研究淡豆豉药材的质量提供了新方法。

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