张胜利,李东方,周岩

（河南科技学院,河南新乡453003）

条锈病是小麦的重要病害.种植抗病品种是防治小麦条锈病的最经济、有效又环保的措施[1].已经定位的小麦条锈病抗病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr24和Yr26对我国目前3个流行优势生理小种（CY30,CY31,CY32）都表现为免疫或高抗,遗憾的是目前只有Yr10被克隆,这与小麦基因组复杂、庞大有很大关系[2].随着新一代测序仪的不断普及,包括EST在内的DNA序列数据日益膨胀,这为进行基因的电子克隆提供了丰富的数据[3-4].为给抗病分子育种提供一定的理论基础及技术参考,本研究采用与前人类似的方法进行了小麦Yr5基因的电子克隆研究.

1 材料与方法

以在GeenBank中登录号为JQ318586.1的小麦Yr5基因相关的EST为材料,以NCBI中的EST数据库为主要数据源,采用类似张德礼等[5-6]的方法进行了Yr5基因的电子克隆,并利用BlastX[7]、BlastP[8]、ORF finder、clustalX1.8等相关软件对该基因及其同源基因进行了序列分析.

2 结果与分析

2.1 Yr5基因的cDNA序列电子拼接

经电子拼接得到的Yr5基因的cDNA长为1420 bp,ORF finder预测结果表明,ORF区从14 bp到1419 bp,长1407 bp,编码469个氨基酸；由于没有找到终止密码子及polyA信号,所以电子拼接得到的该cDNA不是Yr5基因的全长（图1）.

图1 电子克隆的Yr5基因的开放阅读框Fig.1 Open reading frame of the in silico cloning gene Yr5

BlastX分析结果表明,电子克隆的Yr5基因与数据库中大麦、高粱、谷子、水稻等的抗病基因具有较高的同源性,蛋白序列覆盖度在97%以上,序列一致性在60%～68%（图2）.以预测的长度为469个氨基酸的蛋白为query,在CDD-42589 PSSMs蛋白保守结构域数据库中进行检索[9],结果表明,该蛋白含有NB-ARC、LRR_8两个抗病基因大多均含有的保守结构域,但所含有的NB-ARC结构域不完整,因此进一步验证了电子拼接的Yr5基因不是全长.

图2 电子克隆的Yr5基因的BLASTX搜索结果（部分）Fig.2 BLAST Xsearch results（in part）of in silico cloning gene Yr5

2.2 同源基因序列比较分析

同源基因的比较是估计电子拼接的Yr5基因全长的有效手段.在NCBI的相关数据库中检索小麦及其近缘种中已被克隆的锈病抗病相关基因,结果见表1.电子克隆的Yr5基因的保守结构域搜索结果见图3.

表1 锈病抗病基因同源序列比较Tab.1 homologous sequences comparation of rust resistance gene

图3 电子克隆的Yr5基因的保守结构域搜索结果Fig.3 Conserved domain search results of in silico cloning gene Yr5

结果表明,小麦锈病抗病基因除Lr1外蛋白长度多在810～930个氨基酸之间,平均为871±62.7个氨基酸；均含有NB-ARC保守结构域,平均长度为283.6±6.19个氨基酸,结构域的起点平均为184.2±16.72个氨基酸.本研究电子拼接的Yr5基因编码蛋白的NB-ARC保守结构域长度为210个氨基酸,从图3及表1可以推测,本研究电子拼接的Yr5基因在NB-ARC保守结构域上靠近N端少了约73个氨基酸,加上结构域的平均起点,N端总共少了约257个氨基酸.据此,还可以推测C端约少了145个氨基酸（871-469-257）.

3 结论与讨论

植物基因克隆常用的方法有图位克隆法、转座子标签法、同源序列法、突变体筛选法、差异筛选法等,这些方法各有其优缺点,在克隆基因时应根据供体基因组大小、被克隆基因的特点、遗传图谱和物理图谱的完备性等选择使用,有时需要通过几种方法的融合.对于小麦来说,由于其巨大的基因组进行基因克隆及验证相当困难,因此,从事小麦分子生物学相关研究的学者们都在积极探索小麦基因克隆的快速有效方法.

随着新一代测序仪的不断普及与完善,包括EST序列在内的DNA序列数据日益膨胀,这为进行基因的电子克隆提供了丰富的数据.张德礼等[5]、黄新杰[6]等在电子克隆方面都做了大量富有成效的工作.本研究采用类似的方法进行了小麦Yr5基因的电子克隆,结果表明克隆到了Yr5基因的大片段,根据同源基因比较推测该电子拼接的基因N端缺少了约257个氨基酸,C端缺少了145个氨基酸.虽然没有拼接到Yr5基因的全长,但本研究拿到了Yr5基因编码蛋白的53.8%（469/871）的长度,这为进一步通过实验手段克隆该基因奠定了良好基础,也为探索小麦抗病基因快速克隆方法提供了一定参考.

[1] 曹必好,宋洪元,雷建军.植物抗病基因研究进展[J].天津农业科学,2001,7（4）：13-15.

[2] 马渐新.小麦抗条锈病基因定位及分子标记进展[J].生物技术通报,1999（1）：1-6.

[3] 胡皝,萧浪涛.生物信息学在新基因全长cDNA电子克隆中的应用[J].生物技术通报,2007（4）：93-96.

[4] Han W L,Ding P G,Xu M X,et al.Identification of eight genes encoding chemokine-like factor superfamily members 1-8（CKLFSF1-8）byin silicocloning and experimental validation[J].Genomics,2003,81（6）：609-617.

[5] 张德礼,孙晓静,凌伦奖,等.人类SR蛋白超家族新成员-SFRS12（SRrp508）的基因克隆和特性分析[J].遗传学报,2002,29（5）：377-383.

[6] 黄新杰.三个小麦抗条锈病相关基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析[D].杨凌：西北农林科技大学,2007：6.

[7] Stephen F A,Thomas L M,Alejandro AS,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Research,1997,25（17）：3389-3402.

[8] Stephen F A,John C W,Gertz E M,et al.Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices[J].FEBS Journal,2005,272（20）：5101-5109.

[9] Marchler-Bauer A,Lu S,Anderson J B,et al.CDD：a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins[J].Nucleic Acids Research,2011,39：225-229.

[10] van der Biezen E A,Jones J D.The NB-ARC domain：a novel signaling motif shared by plant resistance gene products and regulators of cell death in animals[J].Current Biology,1998,8（7）：226-227.