赵 楠，刘 丹，王艳萍，王金凤，魏 颖(解放军第208医院，吉林长春130062)

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata(willd.) Ohwi的干燥花蕾，《神农本草经》记载葛花主要用于解酒醒脾，治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕呃吐酸、吐血和肠风下血等，是具有代表性的解酒药物［1］。解酒保肝作用的成分是葛花中的异黄酮。本研究采用HPLC法可同时测定葛花中鸢尾苷和鸢尾苷元这两种异黄酮的含量，以控制葛花药材的质量，国内报道并不多见。

1 仪器与试药

LC-10AVT高效液相色谱仪(岛津);SPD-10AV检测器(岛津);HP-8452A型紫外分光光度计(美国惠普);CP225D电子天平(德国赛多利斯);葛花(河南广安堂贸易有限公司20100225)，鸢尾苷和鸢尾苷元对照品(实验室自制20050817，20051208，纯度＞99%);水为重蒸溜水;甲醇为色谱纯;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 美国Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);甲醇-乙腈-水(2∶1∶2)为流动相，流速为1.0 ml/min;检测波长264 nm，柱温为室温。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 鸢尾苷对照品:精密称取干燥至恒重的鸢尾苷对照品5.00 mg置25 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理10 min。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得含鸢尾苷200.00 μg/ml的对照品溶液。

鸢尾苷元对照品:精密称取干燥至恒重的鸢尾苷元对照品适量置25 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理10 min。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得含鸢尾苷元80.00 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 葛花药材500 g制成粗粉，用索氏提取器提取。加85%的乙醇回流提取20 h，减压回收乙醇，水浴干燥获得乙醇粗提物。将粗提物用去离子水悬浮，湿法上样于50倍量(W∶ V)的大孔树脂AB-8柱，分别用20%、50%乙醇依次洗脱。收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到葛花混合物。精密称取葛花提取物10.60 mg于10 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，精密量取2 ml置10 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，超声处理20 min，取出，放冷至室温，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

2.3 线性关系的考察

2.3.1 鸢尾苷 精密量取上述鸢尾苷对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得7种不同浓度的鸢尾苷对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样25 μl，测定峰面积。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程:Y=44 122X+5 039.1，相关系数r=0.999 8，鸢尾苷在2.0～120.0 μg/ml范围之内线性关系良好。

2.3.2 鸢尾苷元 精密量取上述鸢尾苷元对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得7种不同浓度的鸢尾苷元对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样25 μl，测定峰面积。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程:Y=61 221.3X－35 086.8，相关系数r=0.998 6，鸢尾苷元在0.8～80.0 μg/ml范围之间线性关系良好。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 分别精密吸取鸢尾苷、苷元对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样25 μl，结果表明，供试品色谱中，在与对照品图谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰。见图1。

图1 HPLC色谱图A-鸢尾苷对照品;B-鸢尾苷元对照品;C-供试品;1-鸢尾苷;2-鸢尾苷元

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一鸢尾苷对照品浓度为20.0 μg/ml的溶液，重复进样5次，每次25 μl，测得鸢尾苷峰面积积分值的RSD为2.9%。精密吸取同一鸢尾苷元对照品浓度为8.0 μg/ml的溶液，重复进样5次，每次25 μl，测得鸢尾苷元峰面积积分值的RSD为1.4%，表示精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一批次的葛花提取物适量制成供试品溶液，重复进样5次，每次25 μl，测得结果苷和苷元的 RSD分别为 1.8%和1.6%，表明重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品10 mg共6份，分别精密加入鸢尾苷和苷元对照品溶液适量，按上述色谱条件测定其含量，计算回收率，结果平均回收率分别为99.7%和99.4%，RSD为分别为1.9%和1.7%，具体结果见表1。

2.5 样品含量测定 葛花药材取5份各500 g，按照2.2.2方法提取制备，得葛花提取物5批(得率为0.1%)，按供试品溶液制备方法制备，按2.1色谱条件依法测定，结果葛花中鸢尾苷和苷元总含量平均为5 g。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

3 讨论

3.1 测定波长的选择 精密称取一定量的鸢尾苷和鸢尾苷元对照品，用流动相溶解配制成含鸢尾苷和苷元为0.08 mg/ml的溶液，于200～400 nm波长范围内扫描，均在264 nm处有最大吸收，故选择264 nm为鸢尾苷和苷元的测定波长。

3.2 本研究建立了同时测定葛花药材中两种异黄酮(鸢尾苷和苷元)含量的HPLC方法，可用于葛花药材中此类成分的定量分析。曾对甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水等流动相进行考察，结果分离度都不理想，试用甲醇-乙腈-水为流动相时，分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，故确定甲醇-乙腈-水为含量测定的流动相。

3.3 用HPLC法测定葛花中黄酮类成分的报道并不多，大多数以紫外分光光度测定，且测定指标的选择也不尽相同。张淑萍等［3］采用HPLC法测定野葛花中葛花苷、次葛花苷及尼泊尔鸢尾异黄酮含量，张国峰等［4］则以HPLC法同时测定了野葛花中葛花苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素A的含量，刘立辉等［5］采用HPLC同时测定野葛花中鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鸢尾苷、鸢尾苷元的含量。有报道表明［6］，存放5年以内的葛花中几乎检测不到葛花苷，而主要的异黄酮成分为鸢尾苷，且葛花产地不同，葛花苷的含量也有明显差别，所以选择鸢尾苷作为测定葛花含量的主要指标成分。本研究结果表明，葛花乙醇提取物中主要的异黄酮成分为鸢尾苷和苷元等，与其他一些相关报道一致［7］。本文所采用的方法简便，可行，准确度高，可同时测定两种主要成分的含量，因此可用作葛花药材质量控制的方法。

［1］ 田代华.实用中药辞典.下卷［M］.北京.人民卫生出版社，2002:1338，1897.

［2］ 尹俊亭，仲 英，孙敬勇，等.葛花化学成分的研究［J］.中草药，2006，37(3):350.

［3］ 张淑萍，贺 云，刘柏涛，等.RP-HPLC测定野葛花中3种异黄酮［J］.分析实验室，2006，25(2):74.

［4］ 张国峰，吴 瑕，白 雪，等.HPLC法同时测定野葛花中4种异黄酮成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2009，26(1):40.

［5］ 刘立辉，李卫民，高 英.HPLC同时测定野葛花中鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖糖苷、鸢尾苷、鸢尾苷元的含量［J］.中国中药杂志，2010，35(17):2308.

［6］ Kim CS，Shin SM，Ha HK，et al.Study of substance change in flowers of Pueraria thunbergiana B enth.during storage［J］.Arch Pharm Res，2003，26(3):210.

［7］ Niiho Y，Nakajima Y，Yamazaki T，et al.Simultaneous analysis of isoflavones and saponins in Pueraria flowers using hplc coupled to an evaporative light scattering detector and isolation of a new isoflavone diglucoside［J］.J Nat Med，2010，64(3):313.