廖世波 赖 琛 张志雄 盛立远 奚廷斐，*

1(温州医学院信息与工程学院，温州 325035)

2(北京大学深圳研究院生物医学工程研究中心，深圳 518057)

引言

因肿瘤、结核、外伤和代谢性骨病等原因造成的骨缺损的修复，一直是外科领域的难题之一。目前常用的异体骨移植、自体骨移植等方法在不同程度上存在一些问题。如自体骨来源极为有限，不能用于修复大面积骨缺损;异体骨存在免疫排斥反应，且可能造成病原体感染(例如HIV病毒、肝炎病毒感染等)。

组织工程的基本方法是将细胞或者活性因子植入三维支架上，模仿天然组织的形态和功能，种植的细胞在支架逐渐降解吸收的过程中增殖分化，最终构建得到具有或部分具有原来特定功能和形态的组织或器官的替代品，从而达到创伤修复和功能重建的目的[1]。

骨组织工程为大面积骨缺损的修复提供了全新的思路和方法，成为各国科学家研究的热点。理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求有[2]：(1)良好的生物相容性：除满足生物医用材料的一般要求如无毒、不致畸等之外，还要利于种子细胞黏附、增殖，降解产物不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化;(2)良好的生物降解性：基质材料在完成支架使命后应能降解，降解速率与组织细胞生长速率相协调，降解时间能够根据组织生长特性作人为调控;(3)具有三维立体多孔结构：基质材料可加工成三维立体结构，利于细胞黏附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，并有利于血管和神经长入;(4)可塑性和一定的机械强度：基质材料可预先制成一定形状，能为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性;(5)骨诱导性和骨传导性;(6)易消毒性。

单一组分的材料常难以满足骨组织工程支架材料的要求，在降解速率、生物活性、骨诱导性等方面存在很多问题。可通过一定的方法将几种单一材料复合，综合各种材料的优缺点，形成复合型支架材料，这在实际应用中取得了良好效果。本文就骨组织工程复合支架材料及其相关问题的研究进展作一综述。

1 复合骨修复材料的研究现状

1.1 纳米复合材料

纳米材料是21世纪备受瞩目的高新技术产品。纳米复合是近年来发展起来的新型技术，能赋予材料新的性能。清华大学崔福斋教授领导的团队，在对人骨骨痂和胚胎骨的分级结构及生物矿化过程的多年研究基础上发明的“瑞福”纳米晶胶原基骨修复材料，2005年4月获得国家食品药品监督管理局的三类植入产品准产注册证，成为国内首个可以在市场上公开销售和应用的纳米医药产品。该材料是国内外首次在体外人工合成的具有与天然人骨成分相同纳米结构的人工基骨修复材料，在骨组织工程领域具有重要的意义。

天然的细胞外基质呈复杂的三维网状结构，对细胞的基本生命活动发挥全方位的作用。Zhang等以六氟异丙醇和三氟乙酸作为溶剂，通过静电纺丝技术组装丝素蛋白(silk fibroin，SF)-羟基丁酸壳聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)复合纳米纤维支架来模仿天然的细胞外基质[3]。扫描电镜结果显示，当HBC含量从20%上升到100%时，纳米纤维的直径也随之增大，水的接触角测量结果证实不同重量比的SF/HBC纳米纤维支架均有好的亲水性。当SF和HBC的重量比为20：80时，支架的机械强度明显提高。细胞试验研究表明这种SF/HBC纳米纤维支架有良好的生物相容性。因此认为静电纺丝SF/HBC复合纳米纤维可以提供理想的仿生组织工程支架。

在纳米水平上改善细胞所处微环境可能有利于细胞黏附、增殖和分化。例如Chen等开发并研究了一种均质纳米羟基磷灰石/聚电解质复合体复合支架，借助聚电解质复合体在其基质中获得的纳米排布的原位结晶引入纳米羟基磷灰石，为纳米复合支架提供细胞生长所需的微环境空间[4]。通过人骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖(细胞存活率测定)、成熟(碱性磷酸酶活性测定)及组织学检查来评估其生物相容性和生物活性。体外BMSCs培养结果显示细胞能很好地浸入支架并生长增殖。该复合材料支架有望用于骨缺损的修复。Shalumon等运用静电纺丝技术将浓度为7%的羧甲基壳聚糖与浓度为8%的聚乙烯醇混合制成层层堆叠的纳米纤维结构，确保了支架具有良好的孔道连通性，为细胞的生存提供了良好的微环境，利于细胞的黏附和生长[5]。

碳纳米管作为一种新型的碳团簇类纤维材料，具有优异的力学性能和不吸收X线特性。Shi等分别制备并比较了聚丙烯酯，超短单壁碳纳米管(US-tube)，和十二(烷)酸酯超短碳纳米管(F-US-tube)纳米复合材料3种支架的性能，体外细胞传导试验证明，细胞在这3种支架上均有良好的黏附和繁殖能力[6]。

1.2 添加活性因子的复合材料

生物活性因子在骨组织的再生过程中起着重要作用，但内源性因子浓度低，不能满足需要，而外源性因子直接加入后会很快随体液扩散和降解，不能在局部维持有效的浓度。如果利用骨组织工程材料的可降解性和缓(控)释作用，就能使外源性因子在较长时间内持续发挥作用。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)能诱导动物和人体间充质细胞分化为骨、软骨等组织。Li等将BMP-2加载到聚氨酯/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)复合材料中，并将其植入大鼠胫骨缺损处，研究发现新骨的形成速度与未添加 BMP-2的骨修复材料相比有明显提高[7]。通过分析 BMP-2的释放动力学曲线可知，植入体内后，BMP-2在一定程度上的暴释有利于诱导成骨细胞的分化，能更好地促进骨缺损的修复。Dai等制备出一种可生物降解的钙/镁复合的，以SiO2为基体的层叠宏观/介孔结构(hierarchically macro/mesoporous structure，CMMS)支架，并在支架上加载重组人骨形态发生蛋白 2(recombinant human BMP-2，rhBMP-2)，形成CMMS/rhBMP-2复合支架体系[8]。该支架体系呈现出相互连通的孔隙网络，大孔隙在200～500 μm，中孔隙为5.7 nm。兔股骨孔洞型缺损模型试验结果表明，与不加载 rhBMP-2的 CMMS支架相比，CMMS/rhBMP-2复合支架上骨再生能力更强。此外，体内载有或不载有rhBMP-2的支架，经过逐渐吸收和骨替换在12周后几乎消失。此项研究证明CMMS/rhBMP-2复合支架具有很好的生物活性、生物相容性和适宜的降解速度，有望应用于临床大的骨缺损修复重建。

移植骨的血管化是移植骨成骨过程中的关键环节，对骨再生和骨融合效果有重要影响[9]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能诱导血管内皮细胞增殖，促进血管形成。Keeney等研究了胶原/磷酸钙复合材料对 VEGF-165的运载能力[10]。试验证明，胶原/磷酸钙能够有效运载 VEGF-165，促进新生血管形成从而加快新骨的形成。

在复合材料上加载抗生素可起到控制感染促进骨愈合的作用。例如Zou等制备并测量了纳米羟基磷灰石-壳聚糖-黄连素(1.0 wt%)复合支架材料的固化时间、抗压强度、抗菌活性等，发现此复合材料固化时间为 16.53～29.43 min，抗压强度为176.06～129.35 MPa，且随着黄连素含量的增加而减小;黄连素释放浓度在1～28 d内均高于最小抑菌浓度(0.02 mg/ml)，能较好地抑制金黄色葡萄球菌生长[11]。而Jia等制备了硼酸盐活性玻璃与壳聚糖的复合材料，并将其作为替考拉宁的载体，用于治疗慢性骨髓炎[12]。体内体外试验均表明，此复合材料不仅能够实现药物的持续释放，而且能促进骨的愈合。

另外，将生物活性成分直接作为复合材料的组份可能改善材料的性能。血浆是血液的重要组成部分，相当于血细胞的细胞间质，其含有血浆蛋白、电解质、营养素、酶类、激素类和胆固醇等重要物质。Bi等将富含血小板的自体血浆、磷酸三钙和壳聚糖混合制备了可注射的骨修复材料[13]。结果显示，富血小板血浆的加入不仅不会对材料的力学性能产生影响，反而能够提高材料的细胞亲合力，有利于成骨细胞的增殖与分化，促进成骨过程。将此材料注射到山羊胫骨缺损处，16周后伤口完全愈合。这一结果为材料的功能化提供了新的思路。

1.3 引入基因工程技术的复合材料

随着基因工程技术的飞速发展，活性因子不再单纯地被添加到材料中，而是通过将其编码基因载体引入材料，以实现活性因子的原位合成和释放。

研究人员将编码rhBMP-7的腺病毒载体复合到壳聚糖/胶原支架材料中接种人牙周膜细胞后，支架植入下颌骨缺损处4至8周，观察到该组的成骨量、碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白和唾液蛋白的表达均高于单纯壳聚糖/胶原组和壳聚糖/胶原复合空腺病毒载体组[14]。另一实验小组将 BMP-2基因转染到人牙龈成纤维母细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)中，然后与胶原基质一起填充于SD大鼠8 mm的颅骨缺损处，与没有转染的HGFs-胶原组、胶原组、空白组进行对照，试验结果显示转染了BMP-2基因的 HGFs-胶原组再生骨的面积明显大于其他3组，说明BMP-2基因的转染可明显诱导体内骨再生[15]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有强烈的促血管生成作用。Qu等用 bFGF基因转染 BMSCs，然后将 bFGFBMSCs种植到纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料支架上，并植入大鼠颅盖骨缺损模型进行试验，检测结果显示，基于BMSCs的bFGF体内基因转染能加速该复合材料支架的血管化和骨组织重建[16]。

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)在缺氧诱导的哺乳动物细胞中广泛表达，是缺氧应答的全局性调控因子。Zou等先通过截断突变的方法构建结构活化型缺氧诱导因子-1α(constitutively active form of HIF-1α)(CA5)，然后使 BMSCs分别转染慢病毒-CA5、慢病毒-WT(wild-type HIF-1α，野生型 HIF-1α)和慢病毒-lacZ[17]。这些基因转染的BMSCs连同钙镁磷酸盐骨水泥支架用来修复大鼠临界尺寸的颅骨缺损。试验结果显示在CA5组和WT组大鼠体内发现有更高局部骨密度的强健的新生骨形成。暗示种植有转染HIF-1α基因的BMSCs的钙镁磷酸盐骨水泥支架材料，可用于修复临界尺寸的骨缺损。

1.4 磁性复合材料

磁场通过影响电荷微粒的运动、膜系统的通透性和生物高分子的磁矩取向等，从而使细胞的生理生化过程发生改变。研究发现，黏附有磁性粒子的整合素(细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附，并介导细胞与细胞外基质之间的双向信号传导)和内化磁性粒子的机械刺激，能诱导细胞内钙信号的改变[18]。Celik等研究证实极低频磁场能增大 SD大鼠的骨密度，使骨特征性碱性磷酸酶(bonespecific alkaline phosphatase，BAP)、 骨 钙 素(osteocalcin)、骨保护因子(osteoprotogerin)和氨基末端肽(N-telopeptide)等显著地发生改变[19]。

将磁性粒子引入骨修复材料，是一种新颖的改善材料性能的方法。磁性支架材料能够通过磁力驱动来吸收体内的生长因子、干细胞或其它生物制剂，并将之束缚于磁性粒子周围，从而促进细胞的黏附和生长。研究者将由羟基磷灰石和胶原制成的标准的商业化支架，在含有各种生物聚合物包被的Fe3O4纳米粒子的液态磁流体中进行浸涂，纳米粒子整合到支架中制成磁性支架。结果表明该支架能促进体外人类骨髓干细胞的黏附和增殖[20]。

Panseri等用不同的磁化方法得到两种羟基磷灰石/胶原(70/30 wt%)磁性支架，仿生相和超顺磁纳米粒子在自组装胶原纤维中直接成核(记为MAG-A)和支架在铁流体溶液中浸渍(记为 MAGB)。磁性支架被植入兔股骨远侧骨骺端和胫骨骨干中部，试验结果显示磁性纳米粒子不引起炎症反应，MAG-A 的兔骨愈 合率 明显高于 MAG-B[21]。Tampieri等将含有Ⅰ型胶原(ColⅠ)的磷酸溶液逐滴滴加到富含磁铁矿纳米颗粒的氢氧化钙悬浮液中，合成结束时，介质的pH值为8。经过一个小时的熟化，洗涤过滤，然后用 1，4-丁二醇缩水甘油醚使材料发生交联，纳米磷灰石在自组装胶原上原位成核，制备了磁性 ColⅠ/HA支架材料[22]。研究结果表明，与相应的非磁性支架相比，这种磁性复合材料支架硬度更大，孔隙率达90±3%，而且没有细胞毒性，能够为人骨髓干细胞的黏附、生长和增殖提供适宜的微环境。试验培养第1 d，细胞就牢固地附着在支架表面并浸入到内部，30 d时可观察到各种形状的成骨样细胞。故认为在外加磁场的引导下，该支架材料能够对骨再生提供帮助。

Wu等试图将磷酸钙陶瓷的骨修复能力与磁场结合起来，通过把超顺磁性纳米颗粒整合到磷酸钙陶瓷中，制得一种新的磷酸钙磁性陶瓷纳米颗粒复合材料[23]。选择出两种磷酸钙陶瓷，羟基磷灰石(HA)和羟基磷灰石/磷酸钙(65/35，hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HT)。分别对大鼠成骨肉瘤细胞株ROS17/2.8和人成骨样细胞MG63进行体外培养;复合有BMP-2的样品植入大鼠背部皮下肌肉筋膜30 d。体内外试验结果均显示，与普通的磷酸钙陶瓷相比，磷酸钙磁性陶瓷纳米颗粒复合材料具有良好的生物相容性，能够显著地促进细胞的增殖和分化。体内试验结果显示羟基磷灰石/磷酸钙磁性陶瓷纳米颗粒能加快BMP-2的表达，可观察到新的骨样组织的形成。预计这种磷酸钙磁性陶瓷纳米颗粒复合材料，可能成为一种潜在的骨替代品或骨组织工程支架。

Meng等用聚乳酸、羟基磷灰石和γ-Fe2O3纳米颗粒，通过静电纺丝技术组装成一种顺磁性纳米纤维复合膜[24]。细胞试验结果显示，在恒定磁场中该复合膜能显著地增强小鼠成骨细胞MC3 T3-E1的增殖、分化及细胞外基质的分泌。认为该复合膜在骨组织工程和骨再生治疗中有广阔的运用前景。综合目前报道的相关研究成果来看，磁性材料由于其特有的生物磁力导向性，在未来骨组织工程材料应用中很可能成为一个非常有前景的方向。

2 复合材料的血管化

骨组织工程的成功与否取决于能否迅速而有效地在再生组织中形成功能化血管。当前由于营养灌注和传输局限的问题，特别是氧扩散，约束了组织工程构建(即再生组织的功能化)，限制了其在体内的整合。一方面，大多数的构建依赖于氧的运输扩散，由于氧扩散的限制，构建内部常发生渐变，导致细胞数目和活力的区域差异，以及由氧和营养浓度不同引起的表型差异[25]。另一方面，当体外生长的组织植入体内时，由于氧和营养扩散极限的存在，使得细胞必须距存活的毛细血管100～200 μm以内[26]。因此，植入前的组织预血管化适当地考虑组织细胞类型、氧和营养扩散率、整个支架的尺寸以及与宿主脉管系统的吻合是很关键的。当前针对组织工程血管化的研究方法可概括为如下几个方面[25]：材料的功能化、支架的设计和精细加工、以细胞为基础的方法、生物反应器设计、微机电系统相关方法、模块式组装以及体内系统。

有学者直接从改良支架材料和寻找功能化的材料入手来研究移植物的血管化问题。如Sun等采用生物大分子层自组装技术，将壳聚糖/肝素复合物涂布于脱细胞骨基质上，体外检测结果显示，该复合物涂层提高了支架的抗凝作用和血液相容性[27]。建立兔骨缺损模型进行试验，断层扫描灌注成像和组织学检查结果，证实了这种巧妙的涂层方法在移植后早期阶段能够促进血液灌注和再生组织的血管化。Mammadov等发现了一种能直接促进血管再生的支架材料，该小组首次报道了通过合成没有添加任何外来生长因子和肝素的纳米纤维肽支架来诱导血管化[28]。他们设计和合成的自组装的两亲性肽分子，能通过模仿肝素的生物活性基团来行使功能。像肝素一样，这种分子能与生长因子相互作用并有效地增强它们的生物活性。体内外试验结果均表明，这种纳米纤维肽支架能在没有外来生长因子或肝素的情况下有效地诱导血管生成。

组织工程支架可以结合或装载上血管原性因子，如血管内皮生长因子[10]、碱性成纤维母细胞生长因子[16]等来促进再生组织的血管化。也可以通过改变其微观结构来创造适宜组织细胞黏附、生长、增殖的微环境，从而改善支架的血流灌注状态。通过改良的单丝螺旋绕组技术生产熔融拉制糖纤维网络的方法，Sun等在聚乳酸三维支架中形成了直径和孔隙率可调的的微孔道[29]。测试结果表明支架呈现出适宜的孔隙率、相互连通微孔网络和机械性能。微孔道循环网络能将氧和养分传送到支架更深的结构部分，这为细胞浸入整个支架并增殖提供了可能性，而后者对血管化来说是至关重要的。进一步的人脐静脉血管内皮细胞培养实验结果显示，该微孔支架没有细胞毒性，同时证实该微孔网络结构利于细胞黏附、增殖和浸入整个支架。

当前组织工程血管化方法的目标，在于通过传送有效的再生细胞与适当的基质和信号分子来克服自然的组织机能紊乱[30]。成熟的血管由内皮细胞和周围血管壁细胞组成。Hegen等将人微血管内皮细胞和肺动脉血管平滑肌细胞，以不同的比例种植到富含基底膜基质的聚乳酸支架中，然后将其植入SCID裸鼠皮下，适时检测内支架微血管形成、融合及灌注[31]。结果显示支架中这两种细胞在体内组装成巧妙的微血管系统，并在植入一周内与宿主循环吻合，内支架微循环显示为一个均匀的分枝状的微血管网络，其中肺动脉平滑肌细胞的分布不是随机的，而是优先聚集到血管周围。故提供全套的血管组件(包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、细胞外基质和信号分子)可促进体内组织工程环境中高效的微血管自组装、功能性微血管的建立及吻合。通过联合移植内皮祖细胞和间充质干细胞，可在多种动物模型上形成显著的脉管系统。这主要是模仿了胚胎血管发生过程：内皮祖细胞和间充质干细胞组织成一个网络并形成外膜细胞稳定的毛细血管床[32]。

成年患者身上可供选择的血管化细胞来源是内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，通过服用粒细胞集落刺激因子，可动员其从骨髓进入血循环到达缺血、炎症以及带有人工祖细胞捕获基序的生物材料部位[33]。Amini等首次特征性地和直接地比较了兔外周血源性内皮祖细胞和骨髓源性内皮祖细胞对体内原始血管网络的形成、改善体内移植成活率、提升血管化率的作用[34]。试验结果显示在促进成骨和促进血管化方面，外周血来源的内皮祖细胞都优于骨髓来源的内皮祖细胞。因此认为外周血源性内皮祖细胞可充当理想的提高血管化和骨组织工程成功率的细胞群。这些研究结果为以细胞为基础的血管化方法未来在临床上的引用提供了可能性。

生物反应器(bioreactor)是利用酶或生物体(如微生物)所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统。作为生物功能模拟机，其在生物医学工程方面有许多应用。其中旋转式生物反应器和灌注式生物反应器可用来克服培养中的物质运输问题，从根本原因上着手缓解了当前组织工程血管化的困境。灌注生物反应器对在体外形成有功能的动脉尤其有帮助[25]。

微机电系统(microelectromechanical system，MEMS)相关方法中的微流体技术，可用于构建微流体通道系统来实现各种复杂的微流体操纵功能。通过微流体系统[25]在合成的或可降解的聚合物中形成血管树样组织，然后将内皮细胞种植到此系统上，能形成初步的脉管系统。

内含细胞的覆盖有融合内皮细胞层的水凝胶组成的微小组织块，可在灌注条件下结合起来形成大块组织，其中内皮细胞层充当抗凝血表面。根据预先测得的营养和氧渗透率，可制成临界尺寸的有一个入口和出口的多血管模块[25]。此方法对于构建临床相关尺寸的工程化组织块似乎是有希望的。模块化组装的一个简单而有效的方法，是紧密堆积表面覆盖有内皮细胞的模块化圆柱形胶原基质，从而在随机装配阵列中形成内皮衬里通道，这些通道可在体内改装成血管化的移植体[35]。

体内系统的原理是在体外小室中利用动静脉环路使组织血管化。通过将融合的细胞片材堆叠起来带血管植入临近动、静脉处，以此增加更多的非细胞层的血管化来构筑组织厚度[25]。从而使突破传统工程化组织的规格限制成为可能。

此外也有学者试图从基因的角度来探讨血管化问题。例如有研究证实缺氧诱导因子-1α上游激活物“总开关”能激活整个前期血管信号瀑布[36]。而超过1000个患者参与的对照控制试验的大量证据也证实了血管原基因治疗的相对安全性[37]。这些研究结果为血管化问题的解决提供了非常有意义的启示。

3 问题与展望

目前，关于组织工程复合材料方面的研究有很多，出现了一些优良的支架材料。但仍有许多亟待解决的问题，如材料接触界面对种子细胞的黏附、增殖、分化有影响;材料的机械强度和降解速率之间的协调性不高;支架材料的血管化有待进一步改善;材料仍有一定的抗原性，其致畸形、致瘤性尚不明确等。此外，这些材料大多数尚处于研发和动物试验阶段，要实现临床应用还需生物学、医学和材料学各领域专家的合作和进一步探索。

未来临床骨缺损的修复都将采用完全可降解吸收的生物活性材料，以避免二次手术取内固定物带来创伤和感染机会;将材料与生长因子基因复合并实现体内适时缓释;或者将抗生素与修复材料复合，修复重建的同时可以达到预防感染的目的等等，这些如能实现，将会给患者带来巨大的福祉。相信随着相关领域理论和技术的进步，骨组织工程材料方面也会取得突飞猛进的发展。

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