鲁吉珂，杨艳坤，司艳红，关方霞

(郑州大学生物工程系 河南 郑州 450001)

帕金森病(Parkinson’s Diease，PD)是中老年人常见的中枢神经系统慢性退行性疾病，其发生与黑质纹状体中多巴胺含量减少有关。脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)属神经营养素(Neurotrophin)家族成员，能够促进多种神经元的存活，尤其对多巴胺能神经元有很强的营养和保护作用，并参与PD的发病与病理进程，被认为是治疗PD的新一代药物［1］。但因为BDNF为大分子物质，不能透过血脑屏障，脑室内用药又极其不方便，给临床的应用带来很大困难。

蛋白转导域家族是自然界中天然存在的一类多肽，能够安全高效地实现多种外源生物大分子的跨膜转导［2］。构建转导肽与BDNF融合蛋白，可实现BDNF跨膜运输并达到对神经系统退行性疾病的治疗目的，国内外文献报道较多。本文从细胞穿透肽和BDNF融合蛋白的国内外研究方面展开综述，旨在为开发基于BDNF融合蛋白相关药物研究提供参考。

1 细胞穿透肽

细胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)，又称蛋白转导域(Protein tansduction domain，PTD)，是一类具有跨膜转导能力的小分子肽段，能以非能量、非受体依赖性的方式把生物大分子跨膜转导入各种细胞内［3］。目前已发现的细胞穿透肽主要包括人类免疫缺陷病毒1型(Human imunodeficiency virus type 1，HIV-1)编码的反式转录激活因子TAT、果蝇同源异型转录因子ANTP、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)转录因子VP22和人工合成的多聚精氨酸及多聚赖氨酸等［2］。

CPP一般分为3类:蛋白转导域PTD，模型多肽和设计多肽。PTD是来源于特定天然蛋白片段具有蛋白转导功能的肽段，如TAT;模型多肽是模仿已知结构CPPs的氨基酸序列，如多精氨酸;设计多肽是根据特定需要设计不同来源多肽片段［4］。不同来源的CPP并没有相似的氨基酸序列，其共同点是为正电荷或两性分子［4］。满足实际应用的CPP分子应当满足下列条件:①小分子，易于合成;②易于和多种分子结合，不改变其转导性能;③对组织、细胞具有较高的选择性;④稳定性好，毒性及副作用小［4］。

CPP及其结合的生物大分子的转导是目前研究的热点，截至2012年3月13日，Pubmed中题目或摘要中含有CPP的文献有523篇，研究较多集中在TAT和ANTP上，见表1。据法国学者 Vivès在2008年的报道，关于TAT和ANTP的文献占CPP的文献75%以上［5］。值得注意的是，作为一种药物运输体系，CPP分子的毒性必须要考虑。目前体外毒性研究较多，而活体毒性报道相对较少。尽管尚未发现CPP的毒性和不良反应，但英国学者Bolton等报道称当10μg或者更高剂量的跨膜肽注射大鼠时，可检测到脑细胞炎症和神经细胞死亡现象，而剂量降低到1 μg时，上述效应大大降低［6］。

表1 Pubmed数据库相关文献检索结果

2 脑源性神经营养因子(BDNF)

BDNF是1982年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，广泛分布于中枢神经系统。BDNF不仅对神经元的发育、增殖分化、存活起重要作用，而且对神经元损伤后的再生修复与功能重塑也起了重要作用［7，8］。因此，BDNF 在神经系统疾病如PD的治疗上有重要的应用前景。但应用BDNF治疗神经系统疾病时，主要存在2个问题。一是人BDNF天然含量极低，每千克组织仅可提取得到微克水平的BDNF，目前尚未找到丰富的组织来源［9］;另一方面，由于存在血脑屏障，BDNF无法进入大脑发挥生物活性，限制了其应用。脑内直接注射BDNF需反复给药、易造成颅内感染，直接应用携带BDNF基因的质粒存在表达不足，而腺病毒又存在安全隐患问题［10］。

通过基因工程手段来制备高纯度BDNF，成本较低，有望解决BDNF来源问题。结合细胞穿透肽跨膜转导技术，采用基因工程方法表达并纯化得到BDNFPTD融合蛋白，将具有治疗作用的BDNF透过血脑屏障而发挥生物效能，有望解决BDNF给药问题。关于BDNF-PTD融合蛋白研究，国内文献较多，如裴明军等［8］构建含PTD与 BDNF融合基因的质粒，并在大肠肝菌中表达，PCR扩增PTD-BDNF融合基因，经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB，转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。石秦东等［8］构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的BDNF融合蛋白真核表达质粒，并对其表达和定位进行研究［11］。英文期刊中关于BDNF融合蛋白文献相对较少，Zhou等［12］将人BDNF与PTD融合表达后，并重点对融合蛋白PTD-BDNF对小鼠脑损伤的保护作用进行研究。关于BDNF的文献总结见表2。但总的来说，目前关于BDNF的文献仍处于实验室研究阶段，临床应用的报道非常少。

表2 关于BDNF融合蛋白相关文献总结

3 融合蛋白表达载体构建

目前融合蛋白表达载体研究集中在原核表达载体，如pET系列，pTAT等。这些表达载体部分为直接商品化产品，部分为研究者自行构建。真核表达载体研究相对较少，此外，还有一部分化学合成的融合蛋白。原核表达简单快捷，表达量大，有多种载体和菌种可供选择，可以多个基因一起表达，技术也较为成熟，但其缺点是无法对蛋白进行翻译后的修饰，一些来源于高级生物的蛋白在原核系统中无法正常折叠，以包涵体的形式存在，需要复杂的蛋白复性过程;真核表达载体具有转录后加工功能，产物以可溶活性蛋白形式存在，提取纯化成本较低，但其表达量相对较低，周期较长，载体价格也较贵［15］。

化学交联的融合蛋白其结构便于控制，有利于研究其结构与膜穿透机理。另外，化学交联法可制备多种结构的新型CPP融合蛋白，如含有非基因编码氨基酸D-氨基酸的融合蛋白，但该方法目前研究较少［16］。关于融合蛋白相关表达载体构建的文献总结见表3。

4 细胞靶向穿膜肽

CPP能够转导各种生物大分子进入各类细胞，但因缺乏细胞特异性，有可能对正常组织和细胞造成毒害作用。通过细胞靶向肽(Cell-targeting peptides)，可提高多肽的细胞特异性。因此将靶向载体与CPP结合起来，寻求具有靶向作用的CPP并构建融合蛋白，可结合两者优点，实现靶向和跨膜两种功能，是未来研究的一个方向［5］。李海玉等［34］成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP)，蛋白转导实验显示得到融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核;该蛋白表达载体具有细胞穿透肽靶向细胞核运输的作用。吴向玲等［35］将能够靶向诱导肿瘤细胞凋亡的凋亡素VP3，构建到内化活性得到提高的改良型穿透肽载体上，构建pET14b-VP3-EGFP-TAT表达载体，得到了具有促凋亡活性的融合蛋白。

5 小结及展望

目前关于CPP的研究主要集中在以下3个方面:①研究CPP结构，揭示其跨膜原因，进而研究发现新的具有蛋白转导功能的CPP，并提高其跨膜转导能力。如 Eiríksdóttir等［33］对10种常用 CPP 分子的二级结构进行比较进行研究，考察了CPP对磷脂膜的作用，并据此对CPP分子进行重新分类;②CPP跨膜机理研究，该部分研究文献较多，但尚未有统一的结论;③拓展CPP在生物大分子物质跨膜运输中的应用［23，30］。

综上所述，细胞穿透肽是一种有力的跨膜工具，将其与靶向肽结合起来，构建具有靶向作用的CPP-BDNF融合蛋白，有助于BDNF透过血脑屏障，直接靶向运送到中枢神经系统内，从而为PD治疗提供新思路。

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