戴晓莉，王敏，杜鸿

Bcl-w属于Bcl-2家族，具有抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用［1］，正越来越多地受到肿瘤研究者们的关注。然而，迄今为止，Bcl-w检测的国产化试剂尚未见报道，开展Bcl-w国产化检测试剂盒的研究，无疑将有助于临床肿瘤检测、监控与治疗。本研究从人胃癌组织中扩增出Bcl-w基因，并通过工程菌成功地表达了Bcl-w蛋白，为推进Bcl-w检测的国产化，进一步探讨该重组蛋白在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Trizol、逆转录试剂盒、pGEM-T载体和质粒提取试剂盒购自Invitrogene公司，LATaq DNA聚合酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、dNTP、EcoRⅠ及XhoⅠ核酸内切酶、T4连接酶、核酸标准参照物DL2000和蛋白标准参照物均购自TaKaRa Biotec公司，X-gal和IPTG购自默克公司，琼脂糖购自上海意图公司，显色试剂购自Amershan Biosciences公司，抗His抗体、羊抗小鼠IgG-HRP购自北京中山生物技术有限公司。原核表达载体、大肠埃希菌DH5α和ROS均由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 取人胃癌组织，将其剪碎研磨，加入1 ml Trizol，室温静置5 min后加入0.2 ml氯仿，充分震荡 15 s，室温静置 10 min;4℃12 000×g离心15 min，取上清加入0.5 ml异丙醇，室温静置10 min后4℃12 000×g离心10 min，弃上清，取沉淀加75%乙醇1 ml涡洗2遍，4℃7 500×g离心5 min，充分去除乙醇，干燥至RNA呈半透明状，最后加入20 μl DEPC水将其溶解。

1.2.2 Bcl-w基因的克隆 根据基因库中人Bcl-w基因编码区序列设计特异性引物，上游：5'-CAGAATTCATGGCGACCC-3'，下游：5'-CGCCTCGAGCCACTTGCTAGC-3'，分别带有酶切位点 EcoRⅠ和XhoⅠ，由上海生工生物工程技术有限公司合成。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，并以其为模板PCR，利用特异性引物扩增人Bcl-w基因。PCR 反应体系：25 μl 2 × GC 缓冲液 I、6 μl dNTP(2.5 mmol/L) 、2 μl cDNA、0.5 μl LA Taq 酶(5 U/μl) 、1μl P1 及P2 引物、14.5 μl H2O，总体积50 μl。反应条件：94℃预变性5 min，之后94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30次，最后72℃延伸10 min。……