刘利波，王莉莉

(军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室，北京100850)

高内涵分析在新药发现毒理学中的应用进展

刘利波，王莉莉

(军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室，北京100850)

在新药发现早期开展发现毒理学研究是提高新药研发效率的重要策略之一。高内涵分析(HCA)是基于高效新药筛选需求发展起来的一项新技术，其主要特点是基于活细胞、多参数、实时、高通量，能够实现化合物多种生物活性、毒性的早期、快速地检测，为发现毒理学研究提供了高效的技术手段。目前，HCA已用于多种靶器官细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、血管毒性、生殖毒性等检测以及毒理学分子机制的研究，本文就HCA在新药发现毒理学方面的应用进展进行综述。

高内涵分析;发现毒理学;药物毒性

新药研发的高成本、高风险和低产出已成为现代新药创制的主要瓶颈。近年来，尽管组合化学和高通量筛选技术的应用，新化学实体及新药靶的数目迅速增长，但同期进入临床且最终成功上市的新药仅有十分之一［1］。有效性和毒性是导致新药临床失败的主要原因，其中毒性因素占总失败率的30%［2］。另外，近年来，屡有上市新药因毒性问题被撤市或限制使用。因此，临床前特别是在新药发现阶段深入研究化合物的毒性对于优化候选药物质量、提高新药研发效率具有重要意义。

发现毒理学是在新药研发早期阶段开展的先导或候选化合物的毒性筛选和评价，以便及早发现和淘汰有严重毒性、甚至根本不适合继续开发的化合物。然而，受限于药物发现早期受试样品多，样品量少，发现毒理学的研究内容十分有限。

高内涵分析(high content analysis，HCA)［3］是新药筛选的新技术，在保留了高通量能力的基础上，不再是在分子水平针对某种单一靶标进行的筛选，而是在细胞水平针对生物体内多系统、多途径、多种靶标进行的动态筛选，不仅能了解样品相关的细胞生物学的变化，阐明样品与药靶相互作用的关系，还能通过观察细胞形态预测化合物的毒性，实现化合物多种生物活性和毒性的早期、快速、高通量检测［3］，弥补了现有发现毒理学筛选方法在通量、毒性机制检测、潜在毒性揭示全方面的不足，是发现毒理学新兴的和最具效率的技术。本文综述了HCA在新药发现毒理学中的应用及进展。

1 HCA与发现毒理学

HCA系统平台由硬件和软件两个部分组成。硬件主要包括具有自动共聚焦功能的高通量荧光显微镜、自动载板与升降平台、高分辨率CCD相机等，可以高速、自动化、动态地获取高质量的细胞成像。软件有强大的高通量的图像分析功能，能够定量分析包括细胞内靶标蛋白空间位移、空间位移动力学、目标蛋白强度、细胞周期、配体/受体颗粒形成、神经生长、形态学、细胞凋亡和微核形成等的变化。因此，HCA是一种基于细胞表型和途径分析的高效新药筛选技术。

组织病理学是评价化合物毒性的金标准。体外以细胞形态为基础的图像分析与组织病理学具有直接的相关性，完全适用于与受试样品靶标相关和非相关的组织病理学的终点，如细胞坏死、凋亡、脂肪变性、磷脂质病、微核、线粒体异常和氧化应激等的测定。并且活细胞信号转导途径分析所反映的分子作用机制能够提示被测样品的潜在毒性。可见，毒理学的研究内容也大都是以细胞分析方法为主。HCA可以在细胞水平高通量、平行、动态监测多种毒性指标在单次实验中能灵敏全面地捕捉可能由药物毒性引起的细胞形态和标志分子的微小变化，获得药物毒性多重效应及潜在毒性信息。其效率与功能都是其他传统的体外细胞分析方法所不及的。因此，HCA是发现毒理学研究最有效的技术，通过细胞水平全面的毒性分析，优化候选化合物的质量，切实提高新药发现效率。

2 HCA在发现毒理学中的应用

2.1 HCA用于靶器官细胞毒性的分析

细胞毒性是药物损伤靶器官的主要原因。由于药物在体内代谢分布、作用于靶组织产生药效，因此，药物可能对特定组织产生细胞毒性反应，诱发组织或器官损伤，最终导致严重的不良反应，如肝毒性和肾毒性;此外，心脏毒性和骨骼肌毒性等器官毒性均与细胞毒性相关。因此，靶组织细胞毒性评价是药物毒理学评价的重要内容。常规的细胞毒性检测内容包括膜完整性的丧失或细胞溶解、凋亡、关键大分子损耗、代谢抑制效应和增殖抑制效应［4］。这些检测可以初步观察化合物毒性特点。然而，不同的方法分开进行，既耗时且难以获得一致的实验数据。

HCA用于细胞毒性测定，在一次实验中平行监测与毒性机制相关的多个参数甚至是信号转导分子，包括细胞核形态、大小和数量、线粒体膜电位、膜完整性、骨架蛋白、氧化胁迫和DNA损伤等，并可通过药物处理的不同时间，确定上述反应为急性或慢性反应。因此，HCA细胞多参数毒性的测定，增加了毒性表型的特异性和选择性，能够分辨出早期可逆效应和晚期不可逆效应，更能全面准确地反映化合物诱导的毒性特征及潜在机制［5］。O'Brien等［6］采用HCA细胞毒性的多参数测定方法，在96孔板上用4种荧光染料(Fluo-4 AM标记胞内钙;TMRM标记线粒体膜电位;Hoechst 33342标记DNA;TOTO-3标记膜通透性)标记HepG2细胞多参数毒性，评价了243种药物诱导的人类肝细胞毒性。结果发现，与7种常用的体外细胞毒性检测法相比，HCA方法的敏感性是93%，特异性达到98%。O'Brien等［7］还用同样的方法筛选了250种化合物的毒性，也证明HCA检测方法的敏感性为90%，特异性则大于95%，可以看出，HCA能够准确反映药物的细胞毒性的特征。目前，针对HCA细胞毒性分析，Thermo Fisher和Millipore公司都有多种专门的试剂盒，包括多参数细胞毒性和多参数细胞凋亡检测等。此外，选择标记细胞毒性特异性标志分子的荧光探针结合商品化多参数细胞毒性试剂盒，可以目标清晰、快速的分析细胞毒的分子机制，如Kim等［8］应用HCA实时监测药物造成的线粒体异常介导的肝毒性，观测线粒体通透性转变、胞内钙离子、胱天蛋白酶3三个指标的实时变化情况，发现奈法唑酮、托卡朋和曲格列酮造成HepG2细胞线粒体功能障碍和后续的细胞凋亡，同时胞内钙离子显著增加，从而造成细胞死亡;另外，观测吡罗昔康处理HepG2细胞后，外围途径介导的凋亡细胞死亡，发现其诱导的细胞凋亡并没有线粒体膜通透性的改变，而是清楚观测到胞内钙离子的增加。以上结果得到胱天蛋白酶8抑制法的证实。Tolosa等［9］结合HCA细胞多参数毒性的监测方法，3和24 h时78种化合物对HepG2细胞的膜完整性、氧化应激胁迫、胞内钙离子浓度和线粒体功能等影响所代表的细胞毒性机制，对其按照损伤程度进行分类。因此，采用HCA分析细胞毒性已成为药物细胞毒性常规高效的检测方法。

2.2 HCA用于遗传毒性的分析

药物遗传毒性主要源于药物损伤DNA，诱发基因突变、染色体突变和基因组突变［10］。HCA用于遗传毒性分析包括微核、DNA损伤和细胞周期抑制分析3个方面。

微核形成是公认的检测染色体异常的方法，是遗传毒性评价的重要依据。最常用的方法是小鼠骨髓红细胞微核检测法。小鼠给药后，解剖取骨髓，再经过离心处理、涂片、固定和染色，最后观察分析微核细胞形成率，一个实验周期需2周以上［10］。HCA分析微核形成，一般采用CHO-K1细胞，通过图像分析和数据处理获得微核形成率。从细胞种板开始，一个实验周期约3 d，并能够高通量进行检测。Diaz等［11］用HCA评价了包含非整倍体诱变剂和断裂剂在内的46种化合物及13种非遗传毒性的化合物对CHO-K1细胞微核形成的影响，结果显示，与人工微核检测相比，HCA方法的敏感性是88%，特异性为100%，对比文献信息，获得了100%阳性预测率和76%阴性预测率。Scott等［12］同样应用HCA评价21种诱变剂和9种非诱变剂化合物，结果与人工微核检测结果相比，两种方法的一致性为83.3%。

DNA损伤作用可以预示化合物存在潜在的遗传和发育毒性。具有DNA损伤作用的化合物或药物往往也表现为明显的细胞周期的抑制效应。采用HCA技术，能对DNA损伤的标志分子组蛋白H3磷酸化，Rad51以及细胞周期进行动态和定量检测。目前，已有商品化的HCA专用DNA损伤、细胞周期检测的试剂盒和分析细胞株，如磷酸化组蛋白H2A.X检测试剂盒、Rad51 Redistribution®试剂盒、G2M细胞周期分析和G1S细胞周期分析细胞株。Gasparri等［13］在骨肉瘤U-2 OS细胞上，通过组蛋白H3磷酸化等特异的标志分子的检测结合细胞周期的分析，筛选出了细胞周期抑制剂，预测了化合物的潜在遗传和发育毒性。需要说明的是，在上述实验中还可以同时检测细胞核的大小及核片段化情况［14］。由于HCA是在96孔或384孔板进行分析，与流式细胞术检测细胞周期相比，HCA所需细胞数量更少，消耗试剂更少，但检测的通量更大，同一实验获得的信息量更大。

由此可见，相对于传统的遗传毒性的检测方法，HCA为新药的遗传毒性的预测提供了更高效的方法。

2.3 HCA用于神经毒性的筛选

神经轴突生长对神经毒药物的反应较一般细胞更为敏感，表现为神经细胞轴突的生长数量和长度减少。另外，神经元死亡导致神经病变，神经胶质(星形胶质)细胞增生。因此，药物诱导的体外培养神经细胞轴突病变的形态学以及共培养中神经元和星形胶质细胞的变化是筛选药物特异性神经毒性的重要内容［15］。传统的神经轴突生长和星形(胶质)细胞的研究是采用形态学和神经胶质酸性蛋白染色，结合图像分析软件对神经轴突数量、平均面积和长度以及神经胶质酸性蛋白着色的程度进行测定［16］，并根据定量分析结果评价化合物的神经毒性。然而，这种方法多为人工操作，工作量巨大，结果判断易受主观因素干扰。HCA可以克服以上局限性，同时检测各项参数，并能通量自动化的进行。如，Anderl等［17］将神经细胞与星形细胞共培养，分别用核荧光染料、荧光抗体标记细胞核，微管蛋白和神经胶质酸性蛋白，采用HCA检测神经元细胞核总数、轴突数和轴突长度，同时检测星形细胞神经胶质酸性蛋白表达量、细胞肥大，增生，进行化合物神经毒性研究，最终获得高通量的、准确的神经毒性相关信息。Radio等［18］采用以PC12细胞系运用HCA方法，通过观察化合物对轴突生长的影响，确定化合物潜在的神经发育毒性，对5种具有明显轴突生长抑制作用的化合物再评价，发现其中3种化合物的神经毒作用主要与降低细胞活力相关。

人多能干细胞来源的功能相关、终端分化的纯细胞，是药物发现与毒理学检测的一个理想模型。Hesley等［19］采用高内涵特有的大CCD系统，以人iPSC-derived iCell®为模型，用抗β微管蛋白荧光抗体标记微管显示神经元网络，Hoechst染核，并用CellMeterTMJC-10标记线粒体，钙黄绿素/AM标记神经突起，从神经元网络、线粒体膜完整性等形态表型的变化观察了不同剂量的激酶抑制剂星孢素，MK571，抗霉素A(antimycin A)，和丝裂霉素C对神经元网络的影响，比较了抗霉素A和缬氨霉素对细胞线粒体毒性相关的神经细胞损伤作用，并通过神经生长和Transfluor®(可识别细胞内2种以上完全不同的颗粒和小点)分析模块，获得了药物毁损神经网络和线粒体膜完整性的毒效-浓度曲线。证实丝裂霉素C和星孢素较MK571，抗霉素A神经细胞毒性更强，IC50相差10倍左右;缬氨霉素和抗霉素A剂量依赖地阻断线粒体的氧化呼吸，前者IC50值低于后者约300倍。可见，结合人多能干细胞来源的神经细胞，HCA是神经毒性的早期检测的有效的工具。

2.4 HCA用于心脏毒性的分析

心脏毒性是导致药物撤市或未能完成临床评价的重要原因之一。提高临床前特别药物研发早期的心脏毒性评价的可预测性十分迫切。现有的体外毒性评价的研究模型主要有工程化的心肌组织和原代心肌细胞、细胞系及胚胎干细胞衍生的心肌细胞［20］。原代心肌细胞主要来源于动物，并且维持困难，可读信息少，而工程化心肌组织尚无标准化产品。因此，细胞系及生物相关性最强的人多能干细胞诱导的心肌细胞成为现代心脏毒性研究的最好模型，并有商品化产品，如GE公司的CytivaTM心肌细胞来自于人类胚胎干细胞，Cellular Dynamics公司的iCell®心肌细胞。这种细胞可形成能收缩的单细胞层，表达心脏相关的转录因子、结构蛋白和具有功能的离子通道，结合HCA技术，可以检测心脏毒性药物影响的细胞行为和表型，包括线粒体呼吸、质膜完整性和胞内钙离子浓度波动等其它细胞形态微小的变化。GE公司［21］使用HCA检测了在临床产生心肌毒性的药物多柔比星、抗霉素A、胺碘酮、双氯芬酸、齐多夫定和硝苯地平对CytivaTM心肌细胞的影响，观察了处理24，48和72 h细胞明场成像引起的形态学的变化和四色荧光标记的细胞核、线粒体膜电位、质膜完整性和胞内钙离子浓度的变化，可以看出不同药物产生不同的细胞图像。通过整理每个药物处理后得到54个细胞学参数，经过主成分分析简化为3个主要成分，由主成分的多维点展示的实验的所有数据可以揭示药物作用总趋势和不同之处，可以很容易看出前3个药物产生明显的急性毒性反应，后3个药物产生的毒性是累积的，这与文献报道一致。在比较前3个药物的心肌细胞表型谱特征时很容易辨别出，由线粒体超氧化生成物介导的心肌细胞毒性时多柔比星与抗霉素A最早产生，胺碘酮产生的毒性反应同时产生，但多柔比星表现为明显的剂量依赖关系，抗霉素A和胺碘酮显示为阈值反应类型，这与临床上其狭窄的毒性-疗效范围相对应。MD公司［22］采用iCell®心肌细胞也获得相同的结果。另外，MD公司通过比较膜片钳与HCA测定iCell®心肌细胞钙通道、钾通道与胞内钙离子浓度波动的研究结果，确认高内涵成像能够实时分析心肌细胞搏动。此外，利用H9C2细胞系，一种来源于BD1X品系大鼠心脏的细胞，Kim等［23］在H9C2细胞建立了HCA心脏毒性药物的检测方法，定量监测胞内离子浓度、钾离子通道的通透性和细胞凋亡/坏死等毒性相关靶标的信息，评价西沙必利、地高辛、喜树碱和新合成的抗肿瘤药物(SH-03)的潜在心脏毒性，并进行化合物心脏毒性机制的研究。说明高内涵检测心肌细胞毒性已建立最完善技术平台，是电生理或其他传统办法无法比拟的技术。

2.5 HCA用于发育毒性分析

药物诱发的血管缺陷是人体四肢畸形和其他系统发育异常的潜在基础，血管异常又是形成流产相关的胎盘缺陷的基础。因此，观察药物对血管生成及血管发生的影响可以预测药物的发育毒性。

斑马鱼是现代药物筛选的新研究对象，属于脊椎动物，其器官在解剖、生理和分子水平都与人类非常相似，其节间血管(ISV)与哺乳动物毛细血管相当，轴向血管相当于大血管(如动脉)，而毛细血管和主血管发育分别属于血管生成和血管发生［24］。此外，斑马鱼胚胎具有体型小，易培养;透明，适于图像为基础的检测。因此，近年来可利用转基因斑马鱼胚胎，结合HCA的筛选优势进行药物或毒物的血管发育毒性的相关研究，如Vogt等［25］利用Tg(Fli1∶EGFP)y1荧光标记血管的转基因斑马鱼胚胎，评价化合物对其胚胎血管发育的影响，从血管长度与总面积两个参数来对化合物的毒性进行综合评价，检测化合物对血管生成的影响。HCA结合斑马鱼模型的优点，实现了整体水平快速、高通量的检测小分子药物对血管形成和发育的影响。

2.6 HCA用于药物毒理学分子机制研究

药物的毒理学效应是通过药物作用于细胞/组织，扰乱细胞内正常信号通路和调节作用，最终产生毒理学效应。随着细胞和分子生物学的理论和技术的快速发展，在细胞水平测试药物毒性反应的信号通路的变化，阐明分子机制成为可能［26］。近来有观点认为，药物产生毒性反应的信号通路的变化可作为特征性毒性反应的标志，是预测人类毒性的有效工具和可能取代动物实验的新的安全性的评价方法［27］。而HCA分析的最大优势就是能在细胞水平对信号通路的变化进行高内涵的定量分析。目前正在建立毒性通路与毒效的关系，希望能为药物毒性预测和早期发现提供有效工具。

3 展望

作为新药筛选革命性的新技术，HCA不仅提供了细胞水平全方位的检测平台，也为发现毒理学的研究提供了高效的工具。但截至目前，与体内毒性对应的HCA早期毒性的方法与模型数量仍然有限，其毒性实验结果与体内毒性相关性的综合性分析尚十分不足，新方法仍在探索中。因此，运用HCA实现预测人类体内毒性尚处于起步与发展阶段。相信随着HCA技术的不断完善与发展，HCA试剂、多参数筛选方法以及与之匹配的软件功能的进一步增强，系统生物学的结合，HCA势必为体外评价化合物潜在人类器官毒性、从机制上了解候选药物的安全性提供高效的手段。

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Application progress of high content analysis in discovery toxicology

LIU Li-bo，WANG Li-li
(Department of Medicinal Chemistry，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China)

One important strategy for improving efficiency of new drug research and discovery is applying discovery toxicology earlier in the drug development process.High content analysis(HCA)，a new technology based on efficient drug screening，employs image based cellular assays in a real-time，high throughput and multiparameter analysis format，allowing identify a variety of biological and toxicological activity of compounds rapidly and early.Thus HCA provides a high-efficient technique for the discovery toxicology study.Currently，HCA has been applied in testing various cytotoxicity，genotoxicity，neurotoxicity，vessles toxicity，reproductive toxicity etc.In addition to those，the molecular mechanism of toxicology could also be studied with HCA.This paper reviewed the progressing of HCA in discovery toxicology.

high content analysis;discovery toxicology;drug toxicity

The project supported by National Key Technologies R＆D Program for New Drug(2012ZX09301003-003)

WANG Li-li，E-mail:wangll63@yahoo.com.cn，Tel:(010)66932674

R99

A

1000-3002(2012)06-0893-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.020

国家“重大新药创制”重大专项(2012ZX09301003-003)

刘利波(1983－)，男，硕士研究生;王莉莉(1963－)，女，博士，研究员，主要从事新药筛选及分子药理学研究。

王莉莉，E-mail:wangll63@yahoo.com.cn，Tel:(010)66932674

2011-11-10接受日期:2012-09-19)

(本文编辑:付良青)