赵灵燕，谢荣辉，朱函坪，徐 芳，杨章女，姚苹苹，周小龙，朱智勇

猪源性乙型脑炎病毒分离株全基因序列测定和分析＊

赵灵燕1，谢荣辉2，朱函坪2，徐 芳2，杨章女2，姚苹苹2，周小龙2，朱智勇2

目的了解猪源性乙型脑炎病毒（乙脑病毒）的基因特征。方法对猪源性乙脑病毒株（JX61）进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果猪源性乙脑病毒JX61株全基因组全长均为10 964个核苷酸，含有一个开放阅读框架，编码3 432个氨基酸。与GenBank中选择的41株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸同源为83．6%～99．3%，氨基酸总体同源性为94．9%～99．6%。通过全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论猪源性乙脑病毒JX61株属于基因I型，与国内分离株XJP613关系最为接近。提示猪体内的乙脑病毒基因型别有了新的变化，这也是浙江省在猪体第一次分离基因I型乙脑病毒。

乙脑病毒；序列分析；种系发生

乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒（JEV），简称乙脑病毒，是引起流行性乙型脑炎的病原体，具有较强的传染性和致病性，其传播地域广，病死率高，严重威胁着人类的健康［1］。乙脑病毒通常在蚊一猪—蚊等动物间循环，其中猪被认为是乙脑最重要的传染源和乙脑病毒传播的主要宿主，在乙脑的流行环节上起重要的作用。因此加强猪体中乙脑病毒的流行状况及变异研究对预防和控制乙脑流行具有重要的意义。目前国内从猪体内分离到乙脑病毒除了HN0701株以外均为基因III型乙脑病毒，较少见到基因I型乙脑病毒，但本实验室2008年从浙江省嘉兴地区分离到的3株乙脑病毒均为基因I型乙脑病毒，提示猪体内乙脑病毒基因型别可能发生了新的变化。为了更好的了解乙脑病毒在猪体内的变异状况，本研究测定了猪源性乙脑病毒分离株（JX61株）全基因组序列并对其分子生物学特征进行了分析，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 病毒株 2008年采自浙江嘉兴某猪场，经BHK－21分离获得并经荧光定量RT－PCR鉴定为乙脑病毒，编号为JX61，－80℃保存备用。

1．2 主要试剂和菌种 RNA提取试剂盒式购Qiagen公司，M－MLV逆转录酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Takara公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自Takara公司，PGEM－T克隆载体购自Promega公司。

1．3 引物设计和合成 根据GenBank中乙脑病毒中乙脑病毒的全基因序列设计了9对相互重叠片段的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 实验中所用引物Table 1 Primer used in the study

1．4 病毒RNA的提取 将病毒接种到长满单层的BHK－21细胞瓶中，接种3～4d，观察病变。当75%以上的细胞发生病变时，收获病毒，用Qiagen公司的RNA提取试剂盒进行抽提。

1．5 RT－PCR和克隆 使用Promega公司的 MMLV，按照说明书操作，用引物合成cDNA，然后用Taq酶分段进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段。并将目的片段克隆于T载体，转化DH5α感受态细胞，在含有Amp、X－gal和IPTG的LB平板培养基上培养18h。选取菌落进行培养，碱裂解法提取质粒，进行阳性克隆株的PCR鉴定。

1．6 序列测定和分析 筛选的阳性克隆经PCR鉴定，选2株送上海生工生物工程有限公司测序，用DNAStar和Clustal X生物软件对其进行序列分析。

1．7 中和试验 将SA14－14－2免疫人体后得到的阳性血清以1∶10、1∶20、1∶40和1∶80稀释后分别与等体积的100TCID50病毒稀释液（JX61株病毒）混合，37℃水浴作为1h后，将其接种于96孔细胞板于37℃细胞培养箱培养1h后，弃去液体后补加100μL放置于37℃细胞培养箱继续培养并观察病变，每个血清稀释度平行做4孔。同时设病毒对照组和乙脑病毒阴性血清对照组。

2 结 果

2．1 乙脑病毒浙江分离株JX61的基因组结构JX61由10 964个核苷酸组成（登录号GU556217），5非编码区由96个核苷酸组成，3非编码区含596个核苷酸组成。97至10 392位编码区，共10 296个核苷酸，编码3 432个氨基酸。JX61株与基因Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ型和基因I型的KV1899和K94P05乙脑病毒序列比较分析表明，JX61在5′NTR的91位存在1个核苷酸的插入（位点以P3株为准，以下皆同），且JX61和其他基因I型乙脑病毒一样在10 395～10 407均存在着13个核苷酸的缺失，可作为基因I型乙脑毒株的分子标记之一。本文中引用的国内基因I型和猪源性乙脑病毒分离株病毒名称、分离时间、分离地点及标本来源背景资料见表2。

2．2 与疫苗株SA14－14－2 ORF编码区的差异分析JX61株与疫苗株SA14－14－2 ORF码区存在1 201个核苷酸差异，核苷酸同源性88．7%，但核苷酸大部分突变属于同义突变，仅引起89个氨基酸核苷酸变异，氨基酸同源性为97．4%。其中在结构蛋白中共有26个氨基酸差异，7个在衣壳蛋白（C）区段，4个在膜蛋白（M）区段，15个在囊膜蛋白（E）区段，其中以衣壳蛋白的差异率为最高，达到5．5%。在非结构蛋白共有63个氨基酸差异，NS1蛋白区段有12个氨基酸差异，NS2蛋白区段有14个氨基酸差异，NS3蛋白区段有11个氨基酸差异。NS4蛋白区段有5个氨基酸差异，NS5基因区段有21个氨基酸差异。

2．3 新分离病毒JX61株与其他乙脑病毒毒株全序列比较和基因组进化树的构建 JX61与41株乙脑毒株的全基因核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较分析，JX61株与其他毒株的核苷酸总体同源性为83．6%～99．3%，JX61株与其他毒株氨基酸同源性均为94．9%～99．6%。JX61株与SH17M－07和XJP613株核苷酸同源性最高，均为99．3%，与JKT6468株核苷酸同源性最低，为83．6%。JX61与SH17M－07和Mie40株的氨基酸同源性最高，均为99．6%，与JKT6468株的氨基酸同源性最低，为94．9%。JX61株与减毒活疫苗株SA41－14－2及P3株的核苷酸同源性只有88．6%和89．1%，但氨基酸同源性分别为97．4%和97．8%。

表2 本研究中使用乙脑病毒毒株信息Table 2 Details of JEV strains from China used for analysis in this study

2．4 新分离株JX61 E基因比较分析 采用减毒活疫苗株SA14－14－2为标准，对新分离的乙脑病毒JX61的E区段核苷酸及氨基酸进行分析。与疫苗株之间核苷酸同源性为87．7%，氨基酸同源性分别为97．0%。新分离株与减毒活疫苗SA14－14－2株存在15个氨基酸位点差异，分别位于Domain I区的E－138，E－176，E－177位，Domain II区的 E－107、E－129、E－222、E－244、E－264、E－279 位，Domain III区的 E－315、E－327、E－366，还有3个位于这3个活性区外的 E－433，E－439和 E－447，而影响病毒抗原抗体结合的E304和E335二个位点的半胱氨酸则没有发生变异。新分离株与国内其他基因I型病毒的核苷酸同源性在97．5%～99．3%。氨基酸同源性为98．4%～99．8% （结果末列）。通过对几十株基因I型乙脑病毒比较结果表明：基因I型乙脑病毒E222位都为S，而基因III乙脑病毒则为A。对GenBank上中国猪源性乙脑病毒分离株进行E蛋白序列比较发现，大多数分离株属于基因III型乙脑病毒，而本实验室分离的JX61、JX66、JX67和河南分离株HN0701则属于基因I型乙脑病毒，表明近年来我国在猪体内的基因型别已经有了新的变化。JX61株与HN0701核苷酸同源性为98．4%，与本实验室分离的猪源性乙脑病毒分离株JX66及JX67的核苷酸同源性则为100%。而与国内其他猪源性分离株的核苷酸同源性均在90%以下，而氨基酸同源性则均在97%以上，表明猪源性乙脑病毒核苷酸虽然差异较大，但大多数属于沉默突变，氨基酸差异较小。分析表明近年来国内分离的猪源性乙脑病毒可分为基因I型和基因III型乙脑病毒，国内猪源性基因III型乙脑病毒E基因序列比较显示各毒株之间核苷酸同源性最低为99．2%、最高为100%。国内猪源性基因I型乙脑病毒E基因序列比较显示各毒株之间的核苷酸同源性最低为98．4%，最高为100%。而猪源性基因I型与基因III型乙脑病毒E基因核苷酸同源性较低，均在90%以下，但氨基酸同源性较高，均在97%以上。

2．5 JX61株进化分析 对JX61株与41株乙脑病毒全基因组序列进行系统进化分析，结果显示明显的4个基因型别，其中基因I型11株，基因II与IV型各1株，基因III型29株。新分离乙脑病毒JX61株属于基因I型乙脑病毒，与2007年分离株XJP613和SH17M－07最接近。

图1 分离自不同国家的42株乙脑病毒全基因序列系统进化分析Fig．1 Phylogenetic trees based on full－length genome of genetic relationships among 42 virus strains

2．6 现行减毒活疫苗免疫机体后产生抗体与JX61株的中和状况 结果显示当阳性血清1∶10和1∶20稀释后与等体积的100TCID50病毒量（JX61株）混合作用后，接种于BHK－21细胞4d后4孔均末发生病变，而当阳性血清1∶40与等体积的100TCID50病毒量（JX61株）混合作用后，接种于BHK－21细胞4d后有3孔则发生了病变。病毒对照组和阴性血清对照组则均发生了病变。表明疫苗株SA14－14－2株免疫人体后产生的抗体能中和JX61株，提示现行疫苗对JX61株具有保护作用。

3 讨 论

乙脑病毒通常在蚊－猪－蚊等动物间循环，乙脑病毒在猪群的长时间贮存与循环可促进病毒的变异，增加环境中该病毒的浓度，而使人感染乙脑病毒的概率提高。因此加强对猪机体内乙脑病毒的研究有助于该类疾病的预防和控制。目前国内外学者已成功地从猪体内分离到多株乙脑病毒并对其进行研究，研究结果显示在日本、韩国等国家猪源性乙脑病毒既有基因I型乙脑病毒又有基因III乙脑病毒，但在中国猪源性乙脑病毒通常为基因III型乙脑病毒［2－5］。而本研究2008年从浙江嘉兴某猪场采集的猪血清中分离到的JX61则属于基因I型乙脑病毒，提示基因I型乙脑病毒在我国部分地区的猪体内存在。以往研究表明近年来国内分离到的猪源性乙脑病毒大多数为基因III型乙脑病毒，且同一地域、猪源性乙脑病毒毒株之间核苷酸和氨基酸均具有较高的同源性，但JX61株则与国内猪源性乙脑病毒的同源性较低，而与蚊虫中分离的基因I型乙脑病毒具有较高的同源性，说明基因I型乙脑病毒在自然界中蚊－猪－蚊循环途径中的各种媒介宿主中存在并进行传播，但基因I型乙脑病毒何时在猪体中流行有待于进一步研究。

系统进化分析显示疫苗株SA14－14－2和分离株JX61株属于不同基因型乙脑病毒，但中和试验表明SA14－14－2减毒活疫苗免疫机体后产生的抗体能中和JX61株，提示现行疫苗对目前流行的基因I型乙脑病毒同样具有保护作用。与SA14－14－2株ORF区核苷酸和氨基酸的比较分析显示存在1 201个核苷酸差异，核苷酸同源性为88．7%，但核苷酸大部分突变属于同义突变，仅引起89个氨基酸变异，氨基酸同源性为97．4%。此外SA14－14－2株和JX61株在主要保护性抗原E蛋白氨基酸对比结果显示：（1）JX61株与SA14－14－2在 E337－345，E377－E382、E397－403三个中和位点的氨基酸均相同［3］；（2）JX61株和SA14－14－2株在E304和E335均为半胱氨酸，而这二个半胱氨酸形成的二硫键是抗原抗体的必要结构［6］；（3）二者的氨基酸同源性高达97．0%。以上这些结果从分子水平上表明现行疫苗对我国分离的不同基因型乙脑病毒都会有很好的免疫保护作用。

目前常采用Pr M／C，E基因片段对乙脑病毒进行基因分型，不能够完全反映乙脑病毒基因组的变异程度，存在一定的不足之处［7－8］。但乙脑病毒株的全基因组序列进化分析最能够准确地描述乙脑病毒株之间的进化关系。JX61与其他毒株相比较，核苷酸 总 体 差 异 率 为0．7% （XJP613、SH17M－07）－16．4% （JKT6468），氨 基 酸 差 异 率 为 0．4%（SH17M－07、Mie40）－5．1%（JKT6468）。从全基因序列进化分析得各JX61株与浙江蚊子分离株XJP613最接近，同属于基因I型乙脑病毒。本实验室自2007年以来从浙江省蚊子和猪体内相继分离到多株基因I型乙脑病毒，提示在浙江省自然界中流行基因I型乙脑病毒，而基因I型乙脑病毒流行的增多很可能对当地乙脑的发病、流行特征产生新的影响，因而需要密切地监测乙脑病毒在自然界中的进化，为更好预防和控制乙脑提供理论依据。

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Complete sequence analysis of Japanese encephalitis virus JX61 strain from swine

ZHAO Ling－yan，XIE Rong－hui，ZHU Hai－ping，XU Fang，YANG Zhang－nu，YAO Ping－ping，ZHOU Xiao－long，ZHU Zhi－yong
（Centre of Animal Disease Control of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China）

In order to understand the genetic characteristics of Japanese encephalitis virus from swine，an JEV was isolated from swine，and its complete genome was sequenced and analyzed comparatively．The results of sequencing of the nucleotides demonstrated that the genome of strain JX61 was 10964 nucleotides in length with a single open reading frame encoding 3432 amino acids．Comparison of the complete genome sequences of different JEV isolates showed JX61 was 83．6%－99．3%nucleotide sequence homology among them，which resulted in 94．9%－99．6%amino acid sequence homology．Phylogenetic analysis through full－length genome showed that the JX61 strain belonged to genotypeⅠ．The phylogenetic analysis based on the entire genome demonstrated that JX61 strain has the nearest genetic relationship with XJP613 and the JX61 might belong to the genotype I．It was the first isolation of Japanese encephalitis virus genotype I from swine in Zhejiang province during recent years．

Japanese encephalitis virus；sequence analysis；phylogeny

R373．3

A

1002－2694（2012）01－0037－04

＊浙江省医药卫生科学研究基金项目（2008B 39）

谢荣辉，Email：ghost＿rhxie＠hotmail．com

1．浙江省动物疫病预防控制中心，杭州 310020；2．浙江省疾病预防控制中心，杭州 310051

2011－04－06；

2011－06－21