陶晨洁 吕广梅 龚涌灵

·综述与讲座·

内皮分化基因受体介导溶血磷脂酸在人胰腺癌的作用及其机制

陶晨洁 吕广梅 龚涌灵

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一种对多种细胞具有不同生物学活性作用的磷脂介质，在组织中广泛存在。LPA通过特定的细胞表面G蛋白耦合受体与细胞相互作用产生生物学效应。该LPA受体被命名为内皮分化基因受体Edg/LPA。在多种人恶性肿瘤中,存在一种叫做自体素/溶血样磷脂(autotaxin/Lyso-PLD)的代谢酶，是 LPA合成的关键酶。LPA通过Edg/LPA受体转导信号影响肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移，起着抗凋亡和促侵袭转移作用[1]；通过上调肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进肿瘤血管生成。LPA还能促进基质金属蛋白酶(MMP, matrix metalloproteinases)和肿瘤血管生成因子的分泌，与肿瘤的局部侵袭转移有关[2]。本文就LPA及其内皮分化基因受体Edg/LPA在胰腺癌发生、发展中的作用进行综述。

一、LPA 生物学特性

1．生化结构： LPA是膜来源的脂质小分子、结构最简单的甘油磷酸酯。其甘油骨架上C-3为磷酸基团、C-2为羟基，从而使LPA具有亲水性，合成后被释放到细胞外起到信号分子的作用。它的Sn位点通过化学键与不同长度的长链脂肪酸结合产生生物活性，具有亲脂性[3]。

2．合成分解代谢：LPA在血清中的含量极微，正常值为1～5 μmol/L。LPA由血小板、成纤维细胞、肿瘤细胞等分泌，与血清蛋白结合存在于血循环。血小板经活化后，磷脂被自体毒素(ATX)溶血磷脂酶(PLD)水解为溶血磷脂，再进一步脱酰化形成LPA,因此，LPA又称血小板衍生因子,这是LPA合成的主要途径。PLD属于焦磷酸酶和磷酸二酯酶家族核苷酸的成员，是LPA合成的关键酶。LPA经磷酸磷脂水解酶(LPPs)降解为单酰基甘油(MAG,Monoacylglycerol lipase)和磷脂酸(PA,phosphatidic acid)[4]。LPA的稳态平衡由合成酶ATX和磷酸磷脂水解酶(LPP)调控维持。除血小板外，其他如某些炎症细胞、神经细胞、损伤细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等受到刺激后均可通过自分泌、旁分泌的形式释放LPA,产生不同的生物学效应[5]。

3．生物学效应：LPA具有激素和生长因子样性能，包含有许多血清生物活性成分。其生物学效应包括：平滑肌收缩、血小板聚集、神经递质释放、促进细胞增殖和抗凋亡、趋化作用和细胞迁移等。LPA可促进VEGF、IL-8、IL-6和生长相关癌基因Gro-1等的形成。这些因子都是癌变过程中的重要介质，因此，LPA可能通过促进肿瘤血管生成以及促进癌细胞的增殖、抗凋亡和局部的侵袭转移等生物学效应而发挥其作用[6]。

二、LPA受体及其信号转导

1．LPA受体的分类：LPA与细胞膜上的G蛋白受体有高亲和性，常见受体包括Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3，该受体被命名为内皮分化基因或溶血磷脂受体亚族(Edg/LPA)。

Edg-2/LPA1：LPA1相对于其他类型的LPA受体,有着更广泛的组织分布。肿瘤组织和正常组织都有LPA1受体的分布。基因敲除LPA1受体的表达或用Ki16425等药物抑制LPA1受体，可持续阻断LPA所致的肿瘤细胞的趋化反应[7]。下调LPA1的表达或活性，能抑制乳腺癌荷瘤裸鼠的骨转移。近来发现转移性肿瘤抑制基因Nm23能抑制多种基因包括Wnt5B、uPA、MMPs、CTGF、c-Met和LPA1等[8]。另一项研究表明，LPA1有下调p53肿瘤抑制基因的功能。用LPA刺激肺癌细胞株，导致p53相关的蛋白酶降解、以及p53相关的浓缩和转录。同样的现象存在于肝癌细胞株的实验[9]。

Edg-4/LPA2：LPA2受体似乎并不是LPA细胞迁移效应的主要载体。然而,有力的证据表明,LPA2受体在恶性肿瘤的表达通常是增强的。卵巢癌细胞LPA2和(或)LPA3 mRNAs是高表达的，而正常卵巢上皮细胞无表达。分化型甲状腺癌有LPA2 mRNA过表达[10]。乳腺癌中最常见的浸润性导管癌有一半以上(57%)有LPA2过表达。胃癌也有LPA2过表达，且肠型胃癌(67%)较浸润扩散型胃癌(32%)更常见。后者的LPA2过表达与淋巴、静脉的浸润,淋巴结转移和肿瘤进展期相关[11]。在结肠直肠癌,LPA2 mRNA明显增加,而LPA1相对低表达， LPA2/LPA1比值增大[12]。最近的一些研究表明，动物模型LPA2的异常表达与肿瘤发生直接相关。经腹腔和皮下注射异常表达LPA2的人癌细胞的卵巢癌裸鼠移植模型，可提高其致瘤性以及侵袭性表现[13]。LPA2转基因小鼠与LPA1或LPA3转基因小鼠相比，更具有侵袭性的致癌表型[14]。对比野生型小鼠,LPA2-缺陷小鼠更加抵抗结肠炎或者ApcMin突变诱导的肠道肿瘤形成。LPA2致癌作用机制并不是很清楚。大多数的研究都集中在LPA2刺激癌基因蛋白表达的能力，包括IL-6、HIF1a、VEGF、cyclin D1、kruppel样因子5和COX-2。

Edg-7/LPA3：LPA3受体很少在正常组织表达；在肿瘤组织的异常表达也不尽一致。LPA3在卵巢癌组织和卵巢癌细胞株有过表达，然而,在其他类型的恶性肿瘤中无异常表达。最近在鼠和人肿瘤细胞的实验表明，通过启动子的过度甲基化，可以沉默LPA3在肿瘤细胞的表达；LPA3的缺失可提高LPA1介导的肿瘤细胞迁移[15]。在哺乳动物细胞，当外源性的LPA3异常表达时，能够触发许多对LPA的细胞反应；但肿瘤细胞中LPA3 更广泛的作用机制还有待完善。

除内皮分化基因受体Edg/LPA这一主要类型外,还存在最近刚被定义过的嘌呤家族成员类新LPA受体：GPR23/LPA4、GPR92/LPA5和GPR87/LPA6[16]。这些LPA受体的性能尚需进一步验证。这一系列非Edg/LPA受体在结构上与Edg/LPA受体相去甚远，它们之间的同源性也低。

2．信号转导：LPA为类生长因子的脂类信号分子，作为第二信使与靶细胞上的受体结合发挥作用[17]。目前已知LPA可能通过以下信号转导途径起作用[18]：(1)通过Gi蛋白抑制腺甘酸环化酶(AC)的活化而减少cAMP的形成，促进细胞生长；(2)通过Gi蛋白β和γ亚基激活Ras、Raf、Erk信号通路，促进细胞增殖，这也是LPA促进细胞增殖的必要途径；(3)通过Gq蛋白偶联作用激活磷脂酶C，使蛋白激酶经磷酸化作用后活化；(4)通过百日咳毒素(PTX，pertussis toxin)易感和非易感二聚体的激活，或通过Ras间接激活Rho,从而发挥细胞骨架重建、细胞形态改变及肌动蛋白应力纤维构建的作用

三、LPA与胰腺癌

近年来，人们越来越多地关注LPA在胰腺肿瘤发病机制中所起的作用。

1．诱导胰腺癌细胞迁移运动：除了促进生长和存活作用外，LPA还是一种强有力的运动因子，可控制细胞的迁移、趋化。有趣的是,主要的LPA合成酶ATX最初是从细胞培养上清液提取的，作为一种肿瘤细胞运动刺激因子刺激细胞运动。因此，LPA和ATX可促进人胰腺癌细胞的侵袭转移[19]。

恶性腹水中的细胞因子和生长因子可调节许多种癌细胞和正常宿主细胞之间的反应。文献报道[20]，通过胰腺癌患者和癌细胞荷瘤老鼠的腹水成分的检测，发现腹水能明显刺激胰腺癌细胞的迁徙，这一现象可被PTX、LPA水解酶、LPA受体拮抗剂(LPA1和LPA3)Ki16425和VPC12249抑制或阻断,而单一的LPA3受体选择性拮抗剂无此作用。这些抑制剂能抑制LPA诱导的细胞反应，而对表皮生长因子诱导的细胞反应无效。恶性腹水中存在的高水平LPA被解释为对细胞迁移行为负责。腹水肿瘤细胞迁移活动强的胰腺癌有极高水平的LPA1受体mRNA表达，迁移活动较弱的癌细胞无此现象。小分子RNA特异性干扰LPA1受体，可抑制受体mRNA的表达和阻断腹水诱导的癌细胞迁移运动。腹水LPA是诱导胰腺癌细胞迁移运动的关键成分,LPA1受体介导这一活动[21]。因此，如Ki16425等选择性LPA受体的拮抗剂，有望成为抗肿瘤细胞迁移和浸润的潜在治疗药物。

我们采用实时RT-PCR检测手术切除的胰腺癌和癌旁组织LPA受体mRNA和蛋白表达。结果显示[22]，胰腺癌和对照癌旁组织LPA1 mRNA的表达无明显差异；而癌组织LPA2 mRNA的表达显著高于癌旁组织；胰腺癌组织和癌旁正常胰腺组织LPA3 mRNA都呈弱表达。提示LPA2受体在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。

2．引发胰腺癌细胞的NF-κB核转位：目前认为[23]，神经肽递质及其信号受体(G蛋白耦合体)可通过自分泌/旁分泌途径促进肿瘤细胞生长。像神经加压素类一样，LPA等生物活性脂质也可诱导人胰腺癌细胞内钙离子快速动员形成钙离子流，LPA所致胞质钙离子流动是NF-κB活化的必要步骤[24]。活化的NF-κB刺激佛波酯活化蛋白激酶C，从而影响LPA与G蛋白受体的结合，激活细胞外蛋白激酶(ERK-1和ERK-2)、促进DNA合成。

使用人重组G蛋白的一项研究表明[25]，Edg2/LPA1受体主要通过PTX易感Gi/o蛋白动员钙离子流动，因此推断Edg4/LPA2受体钙离子动员与“Gq”蛋白和磷酸酯酶C以及与其他一些G蛋白相互作用。采用基因敲除技术的另一项研究显示,LPA能激活几乎所有的磷脂酸酶C(PLC)，而这一反应取决于LPA1和LPA2的内源性表达。PTX和U73122减少了人胰腺癌PANC1细胞LPA所致胞质钙离子流动,提示LPA通过PTX易感G蛋白引发胞质钙动员和磷酸肌醇的生产。LPA1或LPA2很可能在PANC1细胞调动胞质钙过程中起到重要的作用，但目前无法明确是何种LPA受体亚型。

LPA通过G蛋白激活NF-κB，PTX减弱NF-κB活性提示Gi在起作用。通过Gi和G12/13蛋白耦合起作用，Gi可能对NF-κB的激活有重要作用[26]。可以假设,低浓度的LPA激活Gi,高浓度的LPA激活“Gq”，“Gq”蛋白再激活蛋白激酶C和动员足够强度和时段的钙离子流，连同Gi来源的信号，一起激活NF-κB[27]。

LPA激活的NF-κB可能起拮抗增殖信号转导的作用。目前已知,NF-κB的激活与抗凋亡作用相关。最近的研究表明[28],Ⅰ-κBα抑制剂增强了人胰腺癌PANC1细胞对化疗的敏感性,提示NF-κB具有拮抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的重要作用。

3．己糖激酶HK-2在胰腺癌LPA诱导的旁分泌途径中的作用：己糖激酶(hexokinase,HK)是糖酵解途径中的第一个酶,也是肿瘤组织中糖酵解的限速酶。我们前期工作发现，HK-2在人胰腺癌PANC1和MiaPaCa-2细胞异常表达。LPA与G蛋白受体结合介导的信号似乎也可以促进人胰腺癌细胞无氧糖酵解代谢,具体表现在HK-2的量和活性的改变，提示HK-2在胰腺癌微环境LPA诱导的旁分泌途径中起作用。进一步采用3H掺入法检测LPA代谢过程中(糖酵解)的代谢产物3H标记的水平，结果显示，PANC1和MiaPaCa-2细胞LPA诱导的侵袭转移生物学行为与HK-2的活性异常改变密切相关。通过改变LPA的合成或分解代谢，进而调控LPA的最终生物学效应，可能为胰腺癌临床提供了一种新的诊疗策略。

总之，LPA通过内皮分化基因受体Edg/LPA介导信号转导在人胰腺癌的发生发展中的作用，即病理生理学意义以及肿瘤发病机制等，已经逐渐成为该研究领域广泛关注的热点。LPA受体和LPA代谢过程成为有希望的新型靶向目标。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.029

南京医科大学医学重点科技发展项目(08NMUZ042)

210009 南京，东南大学医学院(陶晨洁)；江苏建康职业学院(吕广梅)；南京医科大学附属南京第一医院肿瘤科(龚涌灵)

龚涌灵，Email：Gongyongling26@163.com; ygong@vcu.edu

2011-03-28)

(本文编辑：屠振兴)