陈雪勤，周长艳，黄泽元

(武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉430023)

腌腊鱼制品是我国传统的风味食品，有很广阔的消费市场［1］。传统的发酵鱼主要是通过自然发酵生成，其自然发酵是在较低的温度和较高的食盐浓度下进行［2］，产品存在含盐量高、脂肪氧化过度等质量问题，产品的使用安全性低［3］，而且产品生产周期长，易受环境的影响，稳定性得不到保证。利用微生物纯化培养技术从传统发酵鱼制品中分离纯化得到有益微生物群体，再进行扩大培养，将有益微生物群体直接接种对鱼进行腌制发酵，可以有效地避免传统发酵过程中的不足，提高产品的安全性、风味及感官质量［4］。我们在前期实验中，从传统发酵鱼中分离纯化得到优势乳酸菌［5］主要为干酪乳杆菌、香肠乳杆菌和乳酸乳杆菌［6］，并且得到混合菌种最佳配比(干酪乳杆菌∶香肠乳杆菌∶乳酸乳杆菌=1∶1∶1)。本实验采取直接投入的方式，通过单因素和正交试验以确定直投式复合菌剂生产发酵鱼的最佳生产工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、乳酸乳杆菌，前期在实验室分离纯化得到［6］。

培养基：平板计数琼脂培养基［7］、MRS 培养基［7］。

草鱼、花椒、食盐、八角、桂皮、白糖、味精、生姜，购于武商量贩超市(常青花园店)。

1.2 仪器

SF-400A电子天平、HR2864绞肉机、手提式高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD双人单面净化工作台、VIS-7220可见分光光度计、SH045型恒温恒湿培养箱、ZX-9070MBE数显鼓风干燥箱、凯氏定氮仪、索氏提取仪、Vanox研究显微镜。

1.3 方法

1.3.1 花椒盐的制作

称取1000 g食盐在锅中翻炒至200℃后，加入50 g花椒、5 g八角、5 g桂皮，拌匀后离火继续翻炒使温度下降到50℃以下，然后加入200 g白糖、50 g味精和100 g生姜片，拌匀至冷却后待用［8］。在腌制过程中按照鲜鱼量加入1.41%花椒盐作为腌制调料(其中含食盐1%)。

1.3.2 工艺流程［9］

直投式复合菌剂生产发酵鱼的生产工艺如图1所示。

1.3.3 细菌活化及菌悬液的制备［10］

在无菌操作条件下，用接种环挑取前期分离出的菌种转接到5 mL MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，形成该菌株的液体培养物。取液体培养物l mL转接到10 mL液体培养基中培养24 h，使菌种活化，形成菌悬液原液，并对菌悬液原液计数。根据计数结果对菌悬液原液用无菌水稀释至1×109CFU/mL，再由高到低的顺序依次稀释，形成1×108CFU/mL，1×107CFU/mL，1×106CFU/mL，1×105CFU/mL菌悬液的应用液，供备用。

图1 直投式复合菌剂生产发酵鱼的生产工艺

1.3.4 理化指标的测定方法

(1)总酸度(%)的测定方法：按GB/T12456-2008 NaOH滴定法进行测定。

(2)游离氨基酸含量(%)的测定：单指示剂甲醛滴定法。

(3)挥发性盐基氮(TVB-N)(mg/100 g)的测定：采用微量扩散法。

(4)总蛋白含量(%)的测定：按GB 5009.5-2010凯氏定氮法进行测定。

(5)总脂肪含量(%)的测定：按GB/T5009.6-2003索氏提取法进行测定。

(6)过氧化值(g/kg)的测定：按 GB/T 5538-2005方法进行测定。

1.3.5 微生物指标的测定方法

样品中菌落总数的测定按照GB4789.2-2010进行，乳酸菌的测定按照GB4789.35-2010进行。

1.3.6 感官评定方法

由感官评定小组(由经验丰富的10人组成)，按照参考文献［11］的标准，分别从色泽、腥味、咸味、鲜味和硬度五个指标对发酵鱼制品进行评定，每项指标20分，每个指标均分为4级，按照食品感官评价的要求打分，评价标准如表1所示。

表1 感官评价标准［12］

1.3.7 试验设计

在自然发酵条件下，影响腌腊制品风味的因素主要有食盐含量、腌制温度和腌制时间［13］。本实验主要考察复合菌剂接种量、食盐含量、腌制温度和腌制时间对发酵鱼品质的影响，根据单因素试验确定各指标的大致范围，在此基础上，由优化试验设计及极差分析确定试验的最终方案。

2 结果与分析

2.1 单因素试验及其分析

2.1.1 复合菌剂接种量对发酵鱼品质的影响

在食盐含量7%及温度10℃条件下腌制5 d。腌制结束后，考察复合菌剂(干酪乳杆菌∶香肠乳杆菌∶乳酸乳杆菌=1∶1∶1，由前期试验得到混合菌株的最佳配比)接种量对发酵鱼总酸度、游离氨基酸、TVB-N、总蛋白含量、总脂肪含量的影响，实验结果如表2所示。

表2 接种量对发酵鱼品质的影响

结果表明，随着接种量的增大，发酵鱼中总酸度、游离氨基酸、总蛋白、总脂肪含量逐渐上升，明显高于自然发酵的空白对照组，而TVB-N含量逐渐下降，很明显低于空白对照组。当接种量达到106CFU/g时，试验组总酸含量、游离氨基酸含量、总蛋白含量、总脂肪含量增加很明显，TVB-N值也有较大的下降趋势。当接种量大于108CFU/g时，这5个指标变化均趋于平缓。因此，106—108CFU/g是比较适宜生产的接种量范围。

2.1.2 食盐含量和腌制时间对发酵鱼品质的影响

在前期试验中，对分离出来的菌株做了耐盐性的试验。试验结果表明：复合菌剂在10%食盐条件下仍具有活力。考虑到食盐含量对发酵鱼品质的影响，本试验选取3%—11%的梯度食盐含量作为试验范围［6］。在接种量106CFU/g、温度10℃的条件下腌制。考察不同食盐含量条件下发酵鱼TVB-N值和过氧化值随腌制时间的变化情况，结果如图2，图3所示。

图2 食盐含量和腌制时间对TVB-N的影响

由图2可知，在相同时期，随着食盐用量的增大，发酵鱼的TVB-N值呈减小趋势，而随着腌制时间的增加，各试验组的TVB-N值逐渐增大。在腌制1—2 d时，TVB-N值出现较大的增长，腌制天数大于2 d时，TVB-N值增长缓慢。当添加3%食盐时，TVB-N值明显高于其它试验组，而食盐含量在5%—11%时，发酵鱼的TVB-N值相差很小。因此，发酵鱼腌制过程中食盐含量应高于3%。

图3 食盐含量和腌制时间对过氧化值的影响

由图3可知，发酵鱼过氧化值随着食盐含量的增大而降低，但随着腌制时间的增加而增大。3%，5%和7%食盐含量的试验组腌制3 d后，过氧化值增至较高水平，此后变化趋于平稳。9%和11%食盐含量的试验组在整个腌制过程中，过氧化值均处于较低水平。因此，从样品过氧化值的角度考虑，应采用较高的含盐含量。

综合考虑以上试验指标，当食盐含量大于3%，腌制时间不低于3 d时，可达到较好的腌制效果。食盐含量、腌制时间继续增大，各指标的变化幅度较小。考虑成本、产品风味等因素，食盐含量的大致范围取为5%—7%，腌制时间为3—5 d。

2.1.3 腌制温度和腌制时间对发酵鱼品质的影响

在接种量106CFU/g、食盐含量7%的条件下腌制，考察不同温度条件下发酵鱼TVB-N、游离氨基酸、过氧化值、细菌总数和乳酸菌总数随腌制时间的变化情况，结果如图4—图7所示。

图4 腌制温度和腌制时间对TVB-N值的影响

由图4可知，在相同时期，随着腌制温度的升高，发酵鱼TVB-N值逐渐增大。20℃条件下发酵鱼的TVB-N值明显高于其它实验组。高温条件加速了蛋白质、脂肪等大分子物质的降解，因此为了保证发酵鱼的品质，应选择低温条件下腌制。

图5 腌制温度和腌制时间对过氧化值的影响

由图5可知，在相同时期，20℃试验组过氧化值明显高于其它试验组。各实验组过氧化值均随腌制时间的增加而增大，5℃，10℃条件下上升较为缓慢，在腌制3 d结束时，过氧化值变化趋于平缓。

图6 腌制温度和腌制时间对细菌总数的影响

图7 腌制温度和腌制时间对乳酸菌总数的影响

由图6和图7可知，不同腌制温度条件下，细菌总数的变化趋势与乳酸菌总数的变化趋势相同。随着温度的升高，细菌总数和乳酸菌总数均呈上升趋势。5℃和10℃条件下，细菌总数和乳酸菌总数在整个腌制过程中都处于较低水平。随着腌制时间的延长，各试验组细菌总数和乳酸菌总数都逐渐增大，腌制3 d结束时，变化趋于平缓。从细菌总数与乳酸菌总数的变化情况可以看出，从腌制初期至腌制结束，乳酸菌均占很大比例，进一步说明乳酸菌为发酵鱼加工过程中的优势微生物。

综合考虑以上指标，腌制温度应低于20℃，结合成本、产品风味及口感等，最适腌制温度范围取5—15℃，最佳腌制时间仍然是3—5 d。

2.2 直投式复合菌剂发酵鱼的工艺优化

在单因素试验确定的大致试验范围基础上，复合菌剂接种量、食盐添加量、腌制温度和腌制时间4因素各取3个水平进行正交试验设计，通过感官评分确定最佳直投式发酵工艺，结果如表3所示。

表3 L9(34)正交试验设计及结果分析表

从表3正交试验的直观分析结果表明，各因素对感官评分影响的大小顺序为：A＞C＞B＞D，即接种量影响最大，其次为腌制温度，然后是食盐添加量，腌制时间影响最小。直投式复合菌剂发酵鱼工艺条件的最佳组合为A1B2C2D2，即混合菌种接种量为106CFU/g，食盐添加量为5%，腌制温度为10℃，腌制时间为4 d。在此条件下感官评分为82.8。

3 结论

通过单因素和正交试验所确定的直投式复合菌剂发酵鱼的最优工艺参数为混合菌种接种量为106CFU/g，食盐添加量为5%，腌制温度为10℃，腌制时间为4 d。该条件下生产出的发酵鱼具有红棕色光泽，质地良好，保留了传统发酵鱼的香腊味，而且由于乳杆菌的作用，还具有柔和酸味，产品的TVBN值为18.72 mg/100 g，过氧化值为0.18 g/kg。与自然发酵过程相比，直投式复合菌剂发酵鱼的时间比传统的方法缩短了3 d，同时其TVB-N值和过氧化值分别降低了34.9%和51.6%(试验条件下测得传统发酵鱼的TVB-N值和过氧化值分别为28.74 mg/100g和0.372 g/kg)。该工艺对传统发酵鱼生产的改进有一定参考意义。

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