李蓓，龙梅，郭放，何雪梅，邹立扣，罗燕

(四川农业大学都江堰校区微生物学实验室，四川都江堰611830)

纳豆激酶(nattokinase)是在纳豆发酵过程中由纳豆芽胞杆菌产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。1987年日本的Sumi等［1］首次从纳豆中提取出具有溶血栓作用的纳豆激酶(nattokinase NK)，该酶能显著分解血栓的主要成分—纤维蛋白，激活静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)，从而增加内源性纤溶酶的量及作用效果。纳豆激酶可作为一种具有开发潜力的食品性溶栓药物，源于传统发酵食品，安全性较高，随着人民生活水平的提高，心血管疾病致死率不断提高，纳豆激酶产品具有溶栓效果好、可口服及半衰期长等特点，具有广阔的应用前景，鉴于此，本研究拟筛选出高酶活纳豆激酶菌株，并对其分离纯化，为纳豆激酶产生菌的发酵、产品的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株国内外产纳豆样品，产纳豆激酶Bacillus subtilis ZLK08菌株为四川农业大学都江堰校区微生物学实验室分离获得。

1.1.2 培养基普通营养琼脂培养基购自杭州微生物试剂有限公司。菌种分离培养基(%):葡萄糖0.5，蛋白胨1，牛肉膏0.5，酵母浸出物0.5，NaCl 0.5，琼脂粉1.8，pH 7.0～7.2;种子液培养基(%):葡萄糖1，酵母浸出物1，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO4·3H2O 0.1，pH 7.0～7.2;发酵培养基(%):葡萄糖2，CaCl20.64，酵母浸出物0.74，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 7.0～7.2，药品均为化学纯。

1.1.3 试剂DNA分子量标准DL2000、dNTP及TaqDNA聚合酶等购自天根生化科技(北京)有限公司;蛋白质低范围分子量Marker，16S rDNA引物:27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'引物由上海Sangon生物工程公司合成;纤维蛋白原、凝血酶购自Sigma公司。

1.1.4 仪器与设备Eppendorf微量移液器、Olympus显微镜、PCR仪(Bio-Rad)、层析仪(Biological LP，Bio-Rad)、高速……