孙 涛， 朱 云， 谢 晶， 薛 斌， 周冬香

（1.上海海洋大学 食品学院，上海，201306；2.上海海洋大学 海洋科学研究院，上海，201306）

基于与α－丙氨酸／天冬酰胺美拉德反应的低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能研究

孙 涛1，2， 朱 云1， 谢 晶1， 薛 斌1， 周冬香1

（1.上海海洋大学 食品学院，上海，201306；2.上海海洋大学 海洋科学研究院，上海，201306）

研究低聚壳聚糖（COS）与α－丙氨酸／天冬酰胺（低聚壳聚糖的羰基与氨基的物质量比均为4：1）的美拉德反应。醇沉法提取与α－丙氨酸／天冬酰胺反应8、16 h以及24 h的低聚壳聚糖衍生物，分别记为：CA－8、CA－16、CA－24、CN－8、CN－16以及 CN－24。对衍生物进行红外表征，并研究其对超氧阳离子O2.－、DPPH自由基的清除能力以及还原能力。结果显示：美拉德反应后低聚壳聚糖衍生物抗氧化能力得到显著提高。抗氧化能力强弱次序为CA－8＞CN－8、CA－16＞CN－16、CA－24＞CN－24，即随着反应时间增加，低聚壳聚糖与α－丙氨酸美拉德反应的衍生物抗氧化性始终更强，表明与小分子氨基酸进行美拉德反应制得的壳聚糖衍生物具有更好的抗氧化性。

低聚壳聚糖，α－丙氨酸，天冬酰胺，美拉德反应，抗氧化性能

美拉德反应是在食物中发生的主要反应之一，它由还原性糖、醛或酮的羰基部分和氨基酸、蛋白质或任何含氮化合物的胺基缩合产生。其产物结构复杂、种类繁多，与反应时间、温度以及参与反应的糖和氨基酸等有很大关系［1］。研究表明，氨基酸的结构和种类会影响美拉德反应产物的自由基清除能力［2］。

低聚壳聚糖可以作为羰基的供应体与氨基酸发生美拉德反应。本文研究了低聚壳聚糖与α－丙氨酸和天冬酰胺的美拉德反应，制得低聚壳聚糖衍生物，考察了其对O2·－、DPPH的清除能力以及还原能力，为拓宽低聚壳聚糖的改性和开发天然高效的抗氧化剂提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

低聚壳聚糖（纯度＞90%，脱乙酰度约为70%，凝胶色谱测定其相对分子质量为9 370），购自浙江金壳生物化学有限公司；鲁米诺，DPPH，购自Sigma公司；α－丙氨酸，天冬酰胺，购自国药集团（沪试）；其余试剂均为分析纯，购自上海化学试剂公司；抗氧化测试所需溶液由二次蒸馏水配制。

1.2 主要设备和仪器

WFZ UV2000型紫外分光光度计：上海合利仪器有限公司产品；970CRT荧光分光光度计：南京昕航科学仪器有限公司产品；EQUNOX55傅立叶红外－拉曼光谱仪：德国布鲁克公司产品；IFFM 2D型流动注射化学发光分析仪：西安瑞迈科技有限公司产品。

1.3 低聚壳聚糖衍生物的制备

称取低聚壳聚糖30.0 g两份，分别加入α－丙氨酸0.652 5 g／天冬酰胺1.451 6 g，使得低聚壳聚糖羰基和α－丙氨酸／天冬酰胺的氨基物量比均为4∶1。用300 m L的二次蒸馏水溶解，在80℃下回流反应，经过反复醇沉，制得与α－丙氨酸／天冬酰胺反应8、16以及24 h的低聚壳聚糖衍生物，分别记为：CA－8、CA－16、CA－24、CN－8、CN－16以及 CN－24。

1.4 测试表征

红外光谱在EQUNOX55傅立叶红外－拉曼光谱仪上进行，采用KBr压片法制样，测定波数范围为500～4 000 cm－1，分辨率为0.8 cm－1。

1.5 抗氧化性能测定

1.5.1 对超氧阴离子自由基O2·－的清除用p H＝10.20的0.05 mol／L Na2CO3－Na HCO3缓冲溶液配制浓度为1.5×10－3mol／L的鲁米诺溶液，用1×10－3mol／L的盐酸配制浓度为0.1 mol／L的邻苯三酚储备液，使用前用去离子水稀释至1×10－4mol／L。以缓冲液作为溶剂，配制不同浓度的样品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积［3］。清除率＝（A0－Ai）／A0×100%。其中A0为空白溶液峰面积；Ai为样品溶液峰面积。经SOD，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子

1.5.2 对DPPH自由基的清除在比色管中加入2.0 m L的浓度为1×10－4mol／L DPPH无水乙醇溶液，再加入不同浓度的样品溶液2.0 m L，室温下避光静置半小时，在517 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，无水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。清除率＝［1－（Ai－A j）／A0］×100%［4］。

1.5.3 还原能力的测定pH＝6.60的0.2 mol／L磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 m L，加入到2.0 m L不同浓度的样品溶液中，混匀，置于50℃水浴20 min后迅速冷却，加入2.5 m L 10%三氯乙酸溶液，混匀后在3 000 r／min下离心10 min，取上清液 2.0 m L，加 入 2.5 m L 去 离 子 水 和 0.5 m L0.1%的三氯化铁溶液，静置10 min后在700 nm处测定其吸光度［5］。

2 结果与分析

2.1 低聚壳聚糖美拉德衍生物的测试表征

Maillard反应产物比较复杂，一般都会生成类黑精、还原酮及一系列含N、S的杂环化合物。低聚壳聚糖与α－丙氨酸／天冬酰胺发生美拉德反应，产物经过反复醇沉，可以洗去芳香类、杂环类等一系列小分子，红外表明，醇沉所得产物具有COS的特征结构，故初步认定为低聚壳聚糖衍生物。

图1是低聚壳聚糖及其衍生物（反应24 h）的红外光谱图。壳聚糖及两种衍生物在1100 cm－1附近都有3个较强的多糖特征吸收峰，分别是895、1 085以及1 155 cm－1，这些吸收峰都来自壳聚糖主链环状结构，可作为判定低聚壳聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰［3］。低聚壳聚糖在1 621、1 515和1 381 cm－1附近的吸附带，分别归因于酰胺I（C＝O）、自由氨基（－NH2）和酰胺Ⅲ［6］。且CA和CN在1 621、1 515和1 381 cm－1的峰较低聚壳聚糖有所增强或降低，表明了酰胺I（C＝O）、自由氨基（－NH2）和酰胺Ⅲ的改变［7］，即低聚壳聚糖在美拉德反应后结构发生了改变。

图1 低聚壳聚糖以及两种低聚壳聚糖美拉德衍生物（反应24 h）的红外图Fig.1 FTIR spectra of COS，CA－24 and CN－24

2.2 超氧阴离子自由基的清除

图2 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应8 h）对超氧阴离子的清除能力Fig.2 Scavenging activities of COS，CA－8，CN－8 on superoxide anion

图3 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应16 h）对超氧阴离子的清除能力Fig.3 Scavenging activities of COS，CA－16，CN－16 on superoxide anion

图4 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应24 h）对超氧阴离子的清除能力Fig.4 Scavenging activities of COS，CA－24，CN－24 on superoxide anion

2.3 对DPPH自由基的清除

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，氮原子上有1个孤对电子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm附近有强吸收。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。低聚壳聚糖分子链中的活性氨基和羟基可以提供氢与DPPH结合，从而达到清除 DPPH 的目的［4］。

由图可知，反应时间不同的6种低聚壳聚糖衍生物DPP自由基的清除能力均优于低聚壳聚糖，即抗氧化能力CA－8＞CN－8＞COS、CA－16＞CN－16＞COS、CA－24＞CN－24＞COS。美拉德反应产物对DPPH的清除能力与体系的荧光值有一定关系［9］。本实验表明，壳聚糖衍生物对DPPH自由基的清除能力与反应过程中荧光值的变化结果一致。这与对的清除效果保持一致。

图5 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应8 h）对DPPH的清除能力Fig.5 Scavenging activities of COS，CA－8，CN－8 on DPPH radicals

图6 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应16 h）对DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging activities of COS，CA－16，CN－16 on DPPH radicals

图7 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应24 h）对DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging activities of COS，CA－24，CN－24 on DPPH radicals

2.4 还原能力的测定

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，通过提供电子，阻断Fe2＋向Fe3＋的转变，从而表现出一定的还原能力。研究表明，抗氧化活性和还原能力之间存在着密切的关系［10］。

图8、9、10描述了低聚壳聚糖及其衍生物对DPPH自由基的清除能力。由图可知，6种低聚壳聚糖衍生物对DPPH自由基的清除能力均优于低聚壳聚糖，即抗氧化能力CA－8＞CN－8＞COS、CA－16＞CN－16＞COS、CA－24＞CN－24＞COS。这与前面结果保持一致。

图8 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应8 h）的还原能力测定Fig.8 Reducing power of COS，CA－8，CN－8

图9 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应16 h）的还原能力测定Fig.9 Reducing power of COS，CA－16，CN－16

美拉德反应过程中会产生具有抗氧化性的物质，其中某些有抗氧化性的小分子物质可能生成、积累或者挥发，也可能聚合成抗氧化性较好的大分子物质，如类黑素等。通过美拉德反应制备3种低聚壳聚糖衍生物，尽管消耗了活性氨基，但其衍生物的抗氧化性却得到了较大的提升，其机理也有待进一步研究。

图10 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物（反应24 h）的还原能力测定Fig.10 Reducing power of COS，CA－24，CN－24

3 结语

本实验研究了低聚壳聚糖与α－丙氨酸和天冬酰胺的美拉德反应，并检测了低聚壳聚糖及其衍生物对O2.－、DPPH的清除能力以及还原能力。结果显示，6种低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性均优于低聚壳聚糖，故可以认为美拉德反应是低聚壳聚糖改性的有效手段；随着反应时间增加，低聚壳聚糖与α－丙氨酸美拉德反应的衍生物抗氧化性始终优于低聚壳聚糖与天冬酰胺美拉德反应的衍生物，这可能是由于α－丙氨酸的分子较天冬酰胺小，更易于向羰基进攻发生美拉德反应，生成的衍生物抗氧化性能也更强。表明低聚壳聚糖与葡萄糖的美拉德反应是提高抗氧化性更有效的手段，其机理还有待进一步研究。本研究为制备天然、安全、高效的抗氧化剂提供了很好的思路。

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The Antioxidant Activity of the Chitosan Oligosaccharide Derivatives by Maillard Reaction Between Chitosan Oligosaccharide andα－alanine／Asparagine

SUN Tao1，2，ZHU Yun1，XIE Jing1，XUE Bin1，ZHOU Dongxiang1

（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai，201306；2.Institute of Marine Science，Shanghai Ocean University，Shanghai，201306）

In this study，six kinds of the chitosan oligosaccharide derivatives，named CA－8，CA－16，CA－24，CN－8，CN－16 and CN－24were prepared though Maillard reaction by heating chitosan oligosaccharide andα－alanine／asparagine（the ratio of carbonyl group and amino group was 4：1）at different time.Then，the antioxidant activity of those derivatives was investigated with superoxide anion radical／1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging and reducing power and index.The results indicated that the chitosan oligosaccharide derivatives exhibited more strong antioxidant activity than that of chitosan oligosaccharide.Furthermore，the derivatives from chitosan oligosaccharide withα－alanine had the better antioxidant activity than that of the derivatives prepared by chitosan oligosaccharide and asparagine.The reason is that the derivatives prepared by chitosan oligosaccharide and amino acid with the smaller molecule had the better antioxidant activity.

book=0,ebook=258

chitosan oligosaccharide，α－alanine，asparagines，Maillard reaction，antioxidant activity

Q539

A

1673－1689（2012）05－0531－06

2011－06－27

上海市生物医药和农业科技领域重点科技项目（08391911500）；2009年上海市优秀学科带头人计划（09XD1402000）；上海市教委重点学科建设项目（J50704）。

孙涛 （1970－），女，黑龙江依兰人，理学博士，副教授，主要从事多糖的改性及生物功能的开发。E－mail：taosun＠shou.edu.cn