姚文红，徐香

（青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109）

双波长分光光度法测定牛奶中的钙

姚文红，徐香

（青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109）

采用双波长分光光度法测定牛奶中钙离子的含量。基于在碱性缓冲液中，钙与铬黑T（EBT）-聚乙二醇溶液作用形成1∶1的配合物，利用等吸收双波长消去法，消除EBT自身的干扰。在558 nm和645 nm处测定，得吸光度差ΔA，钙的质量浓度在0～4.8 μg／mL范围内符合比耳定律，线性回归方程为ΔA=0.069 64c+0.009 86，r=0.998 9。用干灰化法处理样品，通过测定样品的ΔA，查得样品中钙离子的含量。该方法测定结果的相对标准偏差为1.7%～7.6%（n=5），平均加标回收率为79.0%～98.7%。

双波长分光光度法；铬黑T(EBT)；钙；牛奶

钙是人体不可缺少的微量元素之一，享有“生命元素”之称［1］。人体自身不能合成钙，所需的钙完全依赖外界的补充和供给。按照营养学家的观点，牛奶中含有丰富的活性钙，其含量居众多食物之首，约是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦猪肉的110倍，因此牛奶是最好的补钙食品。牛奶质量与钙的含量密切相关，因此测定牛奶中的钙含量具有重要意义。

牛奶中钙含量的测定通常采用EDTA滴定法［2.3］、高锰酸钾滴定法［4，5］、火焰原子吸收光谱法［6］、分光光度法等。滴定法存在干扰严重、终点变化不明显等问题，准确度不高；火焰原子吸收光谱法仪器昂贵、难以普及；分光光度法仪器设备简单，操作方便、准确度高。笔者在前人工作的基础上［7，8］，对实验条件进行改进，利用双波长分光光度法测定牛奶中的钙，可消除铬黑T(EBT）自身的干扰，提高测定的灵敏度。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

分光光度计：7200型，上海尤尼柯仪器有限公司；

分析天平：AR1140型，美国奥豪斯国际贸易有限公司；

马弗炉：SX8-10型，上海申光仪器仪表有限公司；

Ca2+标准溶液：400.0 μg／mL，准确称取在105～110℃下预先干燥至恒重的CaCO30.100 0 g，以HCl溶液（1+1）溶解后，煮沸除去CO2，定容至100 mL，使用时根据需要进行稀释；

EBT-聚乙二醇溶液：1×10-3mol／L，准确称取聚乙二醇(2000)5.005 7 g，EBT 0.114 1 g，溶解后，加入少量的盐酸羟胺，防止其氧化褪色，定容至250 mL，使用时根据需要进行稀释；

氨-氯化氨缓冲溶液：pH=10.0；

硼砂-氢氧化钠缓冲液：pH=12.6；

三乙醇胺、盐酸、8-羟基喹啉：分析纯；

实验所用其它试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

（1）样品前处理

准确称取牛奶样品2 g于坩埚中，在电磁炉上炭化至无烟，置于550℃马弗炉灰化2～3 h，冷却后，加入HCl溶液（1+1）溶解，用硼砂-氢氧化钠缓冲液调至中性，定容至100 mL，待测。

（2）标准曲线绘制

于25 mL比色管中，加入EBT-聚乙二醇溶液1.5 mL，氨-氯化氨缓冲液2.0 mL，分别加入0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL Ca2+标 准 溶 液 (40.0 μg／mL)，稀释至刻度。放置10 min，以蒸馏水为参比，测定ΔA（ΔA=A558－A645），以ΔA为纵坐标，钙的浓度为横坐标绘制标准曲线。

（3）样品测定

准确移取2.0 mL待测样品溶液于25 mL比色管中，按标准曲线的制作步骤，加入各种试剂，为消除Mg2+对测定结果的影响，可加入掩蔽剂8-羟基喹啉，测定吸光度ΔA，由回归方程计算样品中的钙含量。

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的选择

于3支25 mL比色管中，分别加入EBT-聚乙二醇水溶液1.5 mL，其中两支加入氨-氯化氨缓冲液 2.0 mL，钙标准溶液 (40.0 μg／mL)0.0，5.0 mL，稀释至刻度，放置10 min，以蒸馏水为参比，在420～720 nm之间，每隔2 nm测定吸光度，得吸收曲线，见图1。

图1 吸收曲线

由图1可知，EBT-聚乙二醇溶液最大吸收波长为540 nm，加入氨-氯化氨缓冲溶液后，最大吸收波长为610 nm，红移70 nm；EBT与EBT和钙形成的络合物对比度为Δλ=52 nm，而且两部分吸收曲线重叠，彼此干扰。利用等吸收双波长消去法，选择645 nm为等吸收波长，测定ΔA(ΔA=A558-A645)，可消除EBT对EBT和钙形成的络合物吸光度的影响。

2.2 测定条件的选择

（1）缓冲溶液用量

在体系中加入不同体积的氨-氯化氨缓冲溶液，测定吸光度。试验表明，缓冲溶液用量在1.00～4.00 mL时，吸光度随缓冲溶液用量的增加，趋于稳定，选用pH 10.0氨-氯化氨缓冲液2.0 mL，可将pH值控制在适宜范围内。

（2）显色剂用量和显色时间

按试验方法，在体系中分别加入不同体积的显色剂，测定吸光度。结果表明，显色剂自身颜色对络合物所显颜色有较大影响，随显色剂用量的增加，吸光度增大，选用1.5 mL EBT-聚乙二醇溶液作为显色剂＝比较合适。体系加入显色剂后在室温下迅速显色，放置5 min后，即可达到稳定，显色完全后，可至少稳定24 h。

2.3 标准曲线方程

对1.2（2）中的系列钙标准溶液进行测定，测定结果见表1。

表1 系列钙标准溶液测定结果

利用表1数据，以ΔA对钙含量进行线性回归，钙含量在0～4.8 μg／mL范围内符合比耳定律，线性回归方程为ΔA=0.069 64c+0.009 86，相关系数r=0.998 9，由工作曲线斜率计算络合物的表观摩尔吸光系数为 0.278 5×104L／（mol·cm）。

2.4 回收试验

在一种牛奶样品溶液中加入一定量的Ca2+标准溶液，按照实验方法进行测定，平行测定5次，计算加标回收率，结果见表2。由表2可知，回收率在79.0%～98.7%之间，说明此方法的准确度较高。

表2 回收试验结果

2.5 样品测定

分别取蒙牛和伊利牛奶样品，按1.2（1）中方法进行处理，测定样品溶液的吸光度ΔA，从标准曲线求出各样品中的钙含量，测定结果见表3。由表3可知，测定结果的相对标准偏差为1.7%～7.6%，说明此方法的重复性较好。

表3 牛奶样品测定结果（n=5）

3 结论

（1）通过实验发现，EBT的吸光度受溶液pH值影响较大，EBT-聚乙二醇溶液最大吸收波长为540 nm，在氨-氯化氨缓冲液中，最大吸收波长为610 nm，红移70 nm。

（2）EBT与EBT和钙形成的络合物的对比度Δλ=52 nm，两部分吸收曲线重叠，利用等吸收双波长消去法，可消除EBT自身颜色对其络合物吸光度的影响，增大检测体系的灵敏度。

（3）在样品处理过程中采用干式灰化法，并用8-羟基喹啉作掩蔽剂，消除Mg2+对测定结果的影响。该法仪器设备简单、操作方便、消耗药品少，除牛奶外，茶叶、蔬菜水果中微量元素钙也可用此法来测定。

［1］张丹凤，陆东林 .牛奶和补钙［J］.农村科技，2001 (3)： 17.

［2］李玉珍，吕宝华，荆志杰.EDTA络合滴定法测定不同品质牛奶中钙含量［J］.山西大同大学学报 (自然科学版 )，2011，27 (1)：42-44.

［3］王喜明，刘玉欣，常凤启，等.滴定法测定保健食品中的钙［J］.中国卫生检验杂志，2006，16 (6)： 754-755.

［4］陈妙兰.高锰酸钾滴定法测定钙片中钙的含量［J］.辽宁化工，2009，38 (4)： 286-288.

［5］加建斌.高锰酸钾滴定法测定补钙制品中的钙含量［J］.安徽农业科学，2007，35(23)： 7 076-7 077.

［6］李敏，王美菡，刘宁，等.火焰原子吸收法测定补钙制品中的钙及其干扰抑制［J］.中国公共卫生，2001，17 (8)： 759-760.

［7］陈伟，白丽明，赵桦萍.铬黑T-聚乙二醇溶液稳定性的研究［J］.信阳师范学院学报(自然科学版 )，2002，15(3)： 303-304.

［8］王军，顾玲.铬黑T作显色剂兼络合剂分光光度法测定钙的研究［J］.陕西科技大学学报，2008，26(4)： 58-60.

Determination of Calcium in Milk by Dual Wavelength Spectrophotometry

Yao Wenhong, Xu Xiang
(College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109 ， China)

The calcium content in milk was detected by dual wavelength spectrophotometric method. Chrome black T(EBT) was used as the color reagent，in pH10.0 buffer solution of ammonia，calcium reacted with EBT-polyethylene glycol to form a stable complex(1∶1). The interference of EBT was eliminated by double wave absorption and elimination technique. At wavelength of 558 nm and 645 nm，the absorbance difference ΔAwas detected and the calcium content obeyed Bee’s law in 0-4.8 μg／mL. The linear regression equation was ΔA=0.069 64c+0.009 86，with correlation coefficient of 0.998 9. The sample was treated with dry ashing method, the content of calcium in the sample was abtained by detecting ΔA. The relative standard deviation of this method was 1.7%-7.6% and the average recovery was 79.0%-98.7%.

dual wavelength spectrophotometry; chrome black T; calcium; milk

O657.3

A

1008-6145(2012)04-0071-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.022

联系人：姚文红；E-mail： qingfoywh@yahoo.com.cn

2012-04-28