卢 楠，朱文华

（1.河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄 050026；2.石家庄科技信息职业学院医药化工系，河北石家庄 050091）

谢氏丙酸杆菌发酵废液中生物抑菌物质的研究

卢 楠1，朱文华2

（1.河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄 050026；2.石家庄科技信息职业学院医药化工系，河北石家庄 050091）

对生产维生素B12的谢氏丙酸杆菌发酵废液中是否存在生物抑菌物质，其性质、抑菌作用大小及抗菌谱进行了研究。研究表明，谢氏丙酸杆菌的发酵液针对检验菌的抑菌效果明显优于化学防腐剂且抑菌谱较广，可以抑制一些革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌，其中主要抑菌成分为等电点在2.0附近的蛋白类物质、丙酸氨、乙酸氨。

生物抑菌物质；发酵液；抑菌作用；抑菌谱

目前，中国食品防腐剂主要采用苯甲酸钠及山梨酸钾，在食品中加入化学防腐剂虽可延长食品保质期，但会影响人类健康［1］，且添加后使食品产生涩味。生物杀菌素是由微生物代谢产生的抗菌物质，主要是一些有机酸、多肽或者前体多肽，分子质量小，结构高度紧密。其作用机制主要是在细胞膜上形成微孔，导致膜通透性增加，产生系统破坏。生物杀菌素能迅速抑制微生物的生长，具有低毒、高效、选择性强、抗菌谱较宽、热稳定性好、适用pH值范围广、使用过程不易产生抗性菌、残留时间短、对环境污染小等特点，并且从微生物发酵液中提取抗菌物质成本低、周期短、操作方便，容易实现工业化生产，因此可以发挥更大的工业应用价值［2］。常见的生物杀菌素有放线菌素（溶菌酶、纳他霉素、泰乐菌素）、细菌素（乳酸链球菌素、乳品丙酸杆菌素）。丙酸杆菌和乳酸菌产生的细菌素在食品防腐剂方面也具有很大的应用潜力［3］。维生素B12厌氧发酵的生产菌是谢氏丙酸杆菌，在代谢细胞内产物维生素B12的同时，发酵废液还应含有细菌素类物质及丙、乙酸盐类，都具有生物抗菌作用，可作为天然、绿色、安全的食品和饲料防腐剂［4］。笔者对谢氏丙酸杆菌发酵液中是否存在生物抑菌物质，其性质、抑菌作用大小及抗菌谱进行了研究，并将其抑菌效果与常用的化学防腐剂的抑菌效果进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测菌菌种

枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，啤酒酵母，黑曲霉。

1.1.2 检测菌培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（细菌培养基），酵母菌，霉菌高糖培养基。

1.1.3 实验仪器

JJ200型精密电子天平，HHBⅡ型电热恒温培养箱，TGL－16C型台式离心机，SW－CY－2FD型洁净工作台，RE－52型旋转蒸发器，HYG－A型全温摇瓶柜。

1.1.4 实验试剂

葡萄糖，浓盐酸，浓氨水，丙酸，NaOH，NaCl，乙酸，双乙酸钠，硫酸铵，苯甲酸钠，100mmol/L磷酸缓冲液，均为分析纯；酵母提取物，牛肉膏，琼脂，胰蛋白胨，考马斯亮蓝，蛋白酶K，蛋白酶，均为生化试剂；维生素B12发酵液，河北华荣制药有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 待检菌种菌悬液的制备

将检测菌活化后置于4℃冰箱内保存待用，配置培养基，包扎、灭菌，在适宜条件下培养待检菌种，制备各待检菌种菌悬液。

1.2.2 待检液制备

用发酵液分别配制以下编号的检测液。1＃：浓缩10倍的发酵液；2＃：浓缩20倍的发酵液；3＃：与10倍浓缩发酵液中丙乙酸浓度相等的丙乙酸钠混合液；4＃：与20倍浓缩发酵液中丙乙酸浓度相等的丙乙酸钠混合液；5＃：未经浓缩处理的发酵液原液；6＃：与发酵液原液中丙乙酸浓度相等的丙乙酸钠对照液；7＃：双乙酸钠对照液（样品浓度超过使用浓度的4倍）；8＃：苯甲酸钠对照液（样品浓度超过使用浓度的4倍）；9＃：HCl对照液；10＃：与10倍浓缩发酵液中丙乙酸浓度相等的丙乙酸氨混合液；11＃：与20倍浓缩发酵液中丙乙酸浓度相等的丙乙酸氨混合液；12＃：10倍浓缩发酵液经浓HCl处理后的上清液；13＃：10倍浓缩发酵液经浓HCl处理后所得沉淀物的磷酸缓冲溶液；14＃：10倍浓缩发酵液经浓氨水处理后的上清液；15＃：10倍浓缩发酵液经浓氨水处理后所得沉淀物的磷酸缓冲溶液；16＃：20倍浓缩发酵液经浓HCl处理后的上清液；17＃：20倍浓缩发酵液经浓HCl处理后所得沉淀物的磷酸缓冲溶液；18＃：20倍浓缩发酵液经浓氨水处理后的上清液；19＃：20倍浓缩发酵液经浓氨水处理后所得沉淀物的磷酸缓冲溶液。由于抑菌成分在pH值为5.5时抑菌效果最明显，故以上液体均将pH值调节至5.5。

1.2.3 检测菌平板制备

将平板灭菌待用，取适量待检测菌种菌悬液混菌倒在平板上。待培养基凝固后，用镊子将无菌棉纸片（厚度为0.5cm）贴于平板相应标记处，取等量待检测液体，放在棉纸片上。将平板放在适宜条件（细菌，37℃；酵母菌、霉菌，28℃）培养1d，观察是否有抑菌圈出现及其抑菌圈大小，以此来确定其是否有抑菌作用及其作用大小。

1.2.4 发酵液抑菌成分及抑菌作用的研究

1）对比发酵液抑菌成分与常规化学防腐剂抑菌效果：选择常规食品防腐剂双乙酸钠、苯甲酸钠作为对照样，样品浓度超过使用浓度的4倍，对检测菌菌种进行抑菌试验。

2）判断抑菌成分是否为发酵产物中的丙酸氨或乙酸氨：以丙酸氨和乙酸氨溶液为对照样，浓度分别相当于10倍浓缩液和20倍浓缩液中丙酸氨和乙酸氨的浓度，用检测菌菌种进行抑菌试验。

3）排除用于样品处理的盐酸、磷酸缓冲液的影响：以相同浓度的且pH值为5.5的盐酸、磷酸缓冲液为对照品，用检测菌菌种作抑菌试验。

4）等电点沉淀物性质的确定：将10倍、20倍发酵浓缩液，分别用浓HCl调节pH值为2.0，有沉淀产生。离心后，将沉淀用pH值为5.5、浓度为25 mmol/L的磷酸缓冲液溶解，其浓度以沉淀物恰好溶解为宜，待测。将10倍、20倍发酵液用浓氨水调节pH值为8.5，有沉淀产生。离心后，将沉淀用pH值为5.5、浓度为25mmol/L的磷酸缓冲液溶解，浓度以沉淀物恰好溶解为宜，待测。上清液用浓HCl调节pH值为5.5，待测。上述2类沉淀分别用考马斯亮蓝法测定，结果见图1和表1。

图1 枯草芽孢杆菌为检测菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of bacillus subtilis for detection

表1 不同检测菌上各检测液的抑菌圈直径大小Tab.1 Antibacterial circle diameter on different bacteria of different detection liquid cm

2 结果与讨论

以枯草芽孢杆菌为例，结果分析如下。

1）由图1可以看出：针对于枯草芽孢杆菌，发酵原液略有抑菌作用，发酵液10倍浓缩液有一定的抑菌作用，发酵液20倍浓缩液抑菌效果较好。由此可以得出：随着发酵液浓缩倍数的提高，其抑菌效果不断增强。但浓缩倍数太大，所耗费的时间和资源也相应增大，从经济角度上是不可取的。常规食品防腐剂，即便浓度为使用浓度的4倍依然没有明显的抑菌效果。可见，发酵液中的抑菌物质抑菌效果远高于常规化学防腐剂。

2）上清液对4种菌都有抑菌作用，丙酸氨、乙酸氨混合液对照对4种菌也有抑菌作用，说明发酵液中的丙酸氨和乙酸氨有抑菌作用，抑菌谱较广，可以抑制一些革兰氏阳性菌和阴性菌，还有真菌。

3）对照样盐酸和磷酸缓冲液均没有抑菌圈，从此排除了酸和磷离子的影响。

4）经考马斯亮蓝溶液对碱性沉淀物和酸性沉淀物进行定性分析，溶液由棕黑色变为蓝色，基本确定2种沉淀物均为蛋白类物质。

在其他检测菌的实验中，各待检液的抑菌效果也出现与枯草芽孢杆菌类似的结果。上述分析表明：谢氏丙酸杆菌的发酵液针对检验菌的抑菌效果明显优于化学防腐剂且抑菌谱较广，可以抑制一些革兰氏阳性菌和阴性菌，还有真菌。其中主要抑菌成分为等电点在2.0附近的蛋白类物质、丙酸氨、乙酸氨。

3 结 语

通过不同检测菌平板，观察各种待检物质所产生的相应抑菌圈的有无及大小来判断抑菌效果及抑菌谱，得出如下结论：发酵液原液的抑菌作用不明显，但是浓缩后抑菌效果明显增强；发酵产物中的丙酸氨、乙酸氨具有明显的抑菌作用。经调酸处理得到的沉淀物抑菌作用明显，抑菌谱也较广，可以抑制一些革兰氏阳性菌和阴性菌，还有真菌，经验证此沉淀物为蛋白质类物质。发酵液中的复合抑菌物质的抑菌效果远高于化学防腐剂的抑菌效果。

基于上述实验结果，可以从丙酸菌厌氧发酵生产维生素B12的发酵废液中分离提取高效广谱的复合生物抗菌物质，并开发其市场应用价值。这样在生产出高附加值产品的同时又避免了发酵废水大量排放所造成的资源浪费及环境污染，不仅能够满足清洁生产、保护环境和促进人类健康的需要，又创造了可观的社会财富，可谓一举多得。

［1］熊 涛，乐易林.生物保鲜技术的研究进展［J］.食品与发酵工业，2004，30（2）：111－114.

［2］雷 虹.L－乳酸菌酸菜发酵液中小肽类天然防腐剂的研究［J］.中国林副特产，2005（2）：44－45.

［3］田文利，吴 琼，吕红线.乳酸链球菌素的研究进展［J］.食品工业，2000（3）：28－30.

［4］仪 宏，王丽丽，冯惠勇.丙酸积累对薛氏丙酸杆菌生长及产酸的影响［J］.微生物学通报，2003，30（3）：29－32.

Study on biological antibacterial material in fermentation liquor of propionibacterium shermanii

LU Nan1，ZHU Wen－hua2
（1.Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College，Shijiazhuang Hebei 050026，China；2.Department of Medicine and Chemical Industry，Science and Technology and Information College of Shijiazhuang，Shijiazhuang Hebei 050091，China）

Whether there is biological antibacterial material in the fermentation liquor of propionibacterium shermanii is studied，so are the nature，the antimicrobial effect and the antibacterial range.The results are as follows：The fermentation liquor has distinct inhibitory effect and wide antibacterial range comparing with chemical preservatives.The inhibitory effect is mainly for Gram－negative，Gram－positive bacteria and mildew.The effective antibiotic composition has protein ammonium propionate and ammonium acetate.at the isoelectric point of 2.0.

biological antibacterial material；fermentation liquor；antimicrobial effect；antibacterial range

TQ920.9

A

1008－1534（2012）03－0138－03

2012－02－21；

2012－03－12

张士莹

卢 楠（1980－），女，河北石家庄人，讲师，硕士研究生，主要从事发酵工艺、酶催化方面的研究和教学工作。