曾青兰，孙连连，王志勇

（咸宁职业技术学院 生物工程系，湖北 咸宁 437100）

L－缬氨酸是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能.在医药上，L－缬氨酸主要用于配制复合氨基酸制剂，特别是应用于配制高支链氨基酸输液及口服液.国内外大批量生产L－缬氨酸均采用微生物发酵法［1］.作者采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CICC20887，在摇瓶条件下研究发酵工艺条件对L－缬氨酸产量的影响，以期为该菌工业化发酵生产L－缬氨酸奠定基础.

1 材料与方法

1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌CICC20887，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心.

1.2 培养基配方

1.2.1 斜面培养基配方 葡萄糖：5.0g／L，NaCl：5.0g／L，牛肉膏：10.0g／L，蛋白胨：10.0g／L，酵母膏：5.0g／L，琼脂条：20.0g／L.用30% 的NaOH调pH＝7，0.1MPa灭菌20min［2］.

1.2.2 种子培养基配方 葡萄糖：25.0g／L，硫酸铵：5.0g／L，玉 米 浆：40.0g／L，豆饼水解液：2.5g／L，磷酸二氢钾：1.0g／L，硫酸镁：0.5g／L，硫酸亚铁：0.01g／L，硫酸锰：0.01g／L，轻质碳酸钙：10.0g／L，L－Met：0.3g／L，L－Ileu：0.2g／L，生物素（VH）：100 μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 的调pH＝7，灭菌条件0.1MPa灭菌20min［3］.

1.2.3 发酵培养基配方葡萄糖：70.0～120.0g／L，硫酸铵：40.0g／L，玉米浆：25.0g／L，磷酸二氢钾：1.0g／L，硫酸镁：0.5g／L，硫酸亚铁：0.01g／L，硫酸锰：0.01g／L，轻质碳酸钙：10.0g／L，生物素（VH）：20～100μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 调pH＝7，0.07MPa灭菌20min［2］.

1.3 发酵工艺条件的设定

采用单因素实验，设定不同发酵工艺条件进行摇瓶发酵，分析不同的发酵工艺条件对谷氨酸棒杆菌CICC20887产缬氨酸的影响.

1.4 L－缬氨酸测定方法

采用纸上层析法.

1.4.1 标准曲线的制定 精密称取缬氨酸标准品0.06g、0.14g、0.22g、0.30g、0.38g、0.46g，分别置于10ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀.分别吸取1μL于层析滤纸上，在层析液［V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（H2O）＝4∶1∶1］中展开，60℃烘干，用0.05%茚三酮－丙酮溶液喷湿，60℃烘干，显色［3］.剪下斑点放入10mL的 CuSO4－75%C2H5OH溶液洗脱，常温静置2h，直至斑点完全洗脱［4，6］.以洗脱剂作……