张芸

（蚌埠市环境监测站，安徽 蚌埠 233000）

藻是一种孢子植物，通过光合作用将二氧化碳转变为碳水化合物，吸收水体中的氮、磷等物质而生长。这使得它们在净化水源 (去除氮、磷)方面有着重要的应用[1-3]。然而藻的过度生长，导致水资源富营养化，从而对水资源带来负面影响。因此藻类与水环境的关系非常微妙。藻类分泌糖类等物质的多少与藻的生长状况和水体的营养物质含量状况相关，因此研究水藻分泌物质(如糖)的含量与水体中总氮、总磷的关系，对研究水藻生长引起的水体富营养化状况，生态保护性利用水资源有重要的意义。

水网藻是一种大型的网片状或网袋状水藻，其繁殖能力强，生长速度快，在生长过程中，能吸收大量的氮和磷等。本文以水网藻为研究对象，用不同氮、磷浓度比的营养液培养水网藻。通过监测含藻水溶液中氮、磷含量与平衡总糖浓度，以考察含藻水体总氮、总磷与溶液中总糖浓度的相关联系。

1 实验部分

1.1 实验器材与药品

硝酸钾：优级纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；磷酸二氢钾：优级纯，国药集团化学有限公司；氢氧化钠、葡萄糖、苯酚、浓硫酸：分析纯，国药集团化学有限公司；过硫酸钾：分析纯，爱见德固赛（上海）引发剂有限公司；抗坏血酸：分析纯，广东汕头市西陇化工厂；酒石酸锑氧钾：分析纯，上海化学试剂总厂；钼酸铵：分析纯，上海胶体化工厂。

TU-1810PC型紫外可见分光光度计、T6-新悦分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；高速离心机，上海仪器公司；水相针头式滤器，孔径0.45μm，直径13mm，安谱科仪公司。

1.2 硫酸-苯酚法测总糖浓度[4]

由于水体中总糖浓度很低，天然产物的分离技术复杂，为简化问题，本文用总糖浓度来表征糖的含量，将总糖酸解为单糖，折合成葡萄糖计算。

分别配置不同浓度葡萄糖标准溶液，分别取所配葡萄糖标准溶液1ml，加入0.5ml 6%的苯酚，再加入7ml硫酸显色。20分钟后，用分光光度计在485nm处测吸光度。以吸光度A与含葡萄糖量X/ug绘制标准曲线为：

取含藻水溶液，用3000r.min-1离心，取上部清液。用水相针头式滤器过滤。取滤液5ml，同时加入5ml的1mol·dm-3盐酸，在80℃的水浴中酸解3h，使溶液中的多糖全部酸解为单糖。冷却液样至室温，用10%的NaOH溶液调节液样pH值在7.5-8.5之间，再将之转移到25ml的容量瓶中定容。取1ml液样，依次加入0.5 ml 6%苯酚和7ml硫酸，20min后用10mm比色皿在485nm处测定吸光度。同时取去离子水作为空白样。利用葡萄糖标定方程式计算总糖含量，然后除以取样体积，计算出总糖浓度。

1.3 过硫酸钾紫外分光光度法测总氮浓度[5]

吸取不同体积的硝酸钾标准使用溶液于25ml比色管中，用无氨水稀释至10ml标线，加入5ml碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱线裹紧管塞，将比色管置于压力蒸汽消毒器中，加热0.5h，放气使压力指针回零，然后升温至120～124℃开始计时，使比色管加热0.5h后停止加热，自然冷却，取出比色管冷至室温，加入（1+9）盐酸 1ml，用无氨水稀释至 25ml，在紫外分光光度计上，以零浓度溶液为参比，用10mm比色皿分别在220nm及275nm处测定吸光度，按A=A220-2A275绘制标准曲线。

吸取适量离心后藻上清液按上述方法测量吸光度，并以去离子水为空白液，用标准曲线方程计算含总氮量，然后除以取样体积，计算出总氮浓度。

1.4 过硫酸钾消解-钼锑抗分光光度法测总磷浓度[5]

吸取不同体积的磷酸盐标准使用溶液于50ml比色管中，加入5%过硫酸钾溶液4ml，加塞后管口包一小块纱布并用线扎紧。置于高压蒸汽消毒器中加热，待锅内压力达1.1kg/cm2时，调节电炉温度使保持此压力0.5h后，停止加热，待压力表指针降至零后，取出放冷。向比色管中分别加入1ml 10%抗坏血酸，混匀。30秒后加2ml钼酸盐溶液充分混匀，放置15min，用10mm比色皿于700nm波长处，以零浓度溶液为参比，测量吸光度。以吸光度A和含总磷量X/ug绘制标准曲线。

取适量消解水样加入50ml比色管中，用水稀释至标线，按绘制标准曲线的步骤显色和测量，代人标准方程得出总磷含量，除以取样体积，计算出总磷浓度。

1.5 藻种选取与培养条件

配 制 营 养 液 ：（NaHCO3,16.8；NaNO3,2.5；K2SO4,1.0；MgSO4·7H2O,0.2；CaCl2·2H2O,0.04；K2HPO4·H2O,0.5；FeSO4·7H2O,0.01；Na-EDTA,0.08）100ml，稀释至 1000 倍。按氮/磷质量比分别为5:1、10:1和45:1加入硝酸钠及磷酸氢二钾。(其P含量为0.3，N含量分别为1.5、3.0和13.5mg·dm-3)。

精心挑选水网藻种，分离、纯化后进行扩大培养。5d后将上述三种营养液1000ml加入玻璃缸中，在自然光照下培养藻。分别简称为样品1、2和3号。实验跟踪监测溶液中的总糖，总氮，总磷浓度。

2 结果及讨论

藻在生长过程要吸收养分，同时还不断的分泌出一些物质。糖是藻细胞壁的主要成分之一，也是主要代谢产物。本文探讨藻生长与糖浓度的关系，水体营养组分氮、磷的含量与糖浓度的关系。

2.1 藻胞外糖浓度随培养时间的变化

通过连续试验，我们发现在藻培养过程中，水体的总糖浓度并不是连续积累的，而是随藻生长状况发生变化。初始阶段(0-17d)，由于营养液组成的差异，藻生长环境不同，总糖浓度也存在差异。就总的趋势来看，3个样品的糖浓度都在减少。此时，藻在生物量增长期，糖浓度的减少是由于糖被消耗或利用，含藻水溶液中总糖浓度与藻生物量呈负相关关系。在t=17d，三个样品的糖浓度均达到各自的一个最低点。

在17～25d阶段，糖浓度随培养时间显著增加，在25d左右达到一个小的高峰。这是因为在糖浓度很低时,藻生长受到抑制，随后出现藻含量降低。由于在藻生长期，水中糖含量减少；若藻生长停止，释放出更多的糖。藻含量降低，从而导致糖浓度开始升高。在观察后期（大于30d），糖浓度除个别点外，在相对稳定的浓度区间波动，表示藻生长维持在一个相对稳定的阶段。

2.2 总氮浓度对总糖浓度的影响

通过试实验我们发现在多数情况下，溶液中总糖浓度与总氮浓度呈一种反向变化关系。即当总氮处于低点时，总糖则处于高点；而当总氮处于高峰时，总糖则处于低谷。

实验结果说明：氮盐不仅影响藻的生长，而且还影响溶液中总糖浓度。氮是藻生长必需的营养元素，参与生物的新陈代谢，决定了藻生物量的累积，是初级生产力的限制因子。当总氮浓度较高时，糖的浓度没有积累，这可能和糖被吸收有关。总氮增大时，它不仅有利于藻的生长，同时也加速细菌和异养生物的生长，此时藻分泌糖的速度并不高，而藻和异养生物的糖消耗量却在增大。另一方面，氮盐还是多糖合成的限制因素[6,7]。藻对氮素缺乏的反应是合成含氮分子和蛋白质的速度降低甚至停止，但光合作用合成碳水化合物的反应仍在进行，相关文献也表明，氮限制条件下，藻的主要活性反应是合成胞外多糖。

2.3 总磷浓度与总糖浓度的关系

磷是植物生长发育的营养元素之一，许多藻类都可以利用不同形式的磷作为生长发育的磷的来源。因此，磷源也是藻类生长的影响因子[3,6]。实验中我们发现水网藻体系在人工培养液条件下，水体中总磷与总糖浓度也呈反向变化关系。总磷与总糖的关系类似于总氮与总糖的关系，对这一关系的解释也有相似的机理。

3 结论

水体富营养化与水藻代谢糖和环境的营养状况有关。在水网藻的培养过程中，总糖浓度并不是连续积累的，而是与藻的生长状况有关，同时受水体中氮、磷营养盐浓度的影响。水体中总氮 总糖、总磷 总糖均呈现反向变化关系。氮、磷浓度增高，有利于促进藻生长，它同时也促进细菌和异养生物等对糖的吸收，总的结果是导致总糖的浓度降低；当溶液中氮、磷浓度降低时，藻合成蛋白等含氮、磷分子的反应停止，但合成碳水化合物以及糖的反应仍继续，从而导致糖浓度的增加。

[1]刘德启、由文辉、李敏，利用水网藻对微藻的抑制作用净化水源 [J]，中国给水排水，Vol.20,2004

[2]Stary.J,Zeman.A,and Kratzer.K 1987.The uptake of ammomium,nitrate and nitrate ions by Hydrodictyon reticulatum.Acta Hydrochim.Hydrobiol 15(2):193-198

[3]Przytocka-Jusialk M Duszota M,Matusiak K et al.Intersive culture of Chlorella vulgarisl AAsa the second stage of bilological purification of nitrogen industry wastewaters.Wat Res,1984,18:1-7

[4]朱成文,白同春,刘德启,姚微微,硫酸苯酚法和焦糖化分光光度法相结合测定藻类水溶液中总糖浓度。苏州大学学报(自然科学版),2005,21(2):63-67

[5]水与废水监测分析方法（第四版），中国环境科学出版社。

[6]B覬rsheim K.Y.,Myklestad S.M.,Sneli J.-A.,Monthly profiles of DOC,mono-and polysaccharides at two locations in the Trondheimsfjord(Norway)during two years.Marine Chemistry,1999,63:255-272

[7]尤珊,郑必胜,郭祀远,氮源对螺旋藻生长及胞外多糖的影响，食品科学,2004,25(4):32-35.