陈 春,周启星 (1.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津 300071；2.农业部环境保护科研监测所,天津 300191)

蚯蚓金属硫蛋白定量PCR检测方法及其分子诊断

陈 春1,2,周启星1*(1.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津 300071；2.农业部环境保护科研监测所,天津 300191)

根据GenBank中蚯蚓(Eisenia fetida)金属硫蛋白(MT)基因序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出目的基因片段,将目的基因片段插入pEASY-Blunt中制备质粒标准品.通过不同梯度稀释倍数的质粒标准品,建立了目的基因MT与内参基因β-actin的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法.通过土壤染毒培养实验,将蚯蚓分别暴露于50,500,1000mg/kg 重金属Cd染毒的自然土壤中培养14,28d,研究蚯蚓体内MT mRNA转录水平的表达变化.结果表明,重组质粒测序后显示目的片段序列同源性好,证明所设计的MT、β-actin引物能成功用于蚯蚓MT mRNA的检测.两基因构建的荧光定量标准曲线线性关系分别为0.994,0.999,且PCR扩增效率也皆接近于100%.染毒实验发现,Cd可诱导蚯蚓体内MT mRNA的表达,其表达水平与Cd污染暴露呈现出剂量-效应和时间-效应关系,表明蚯蚓MT基因可作为潜在分子标志物,诊断环境中Cd污染及其暴露水平.

金属硫蛋白；蚯蚓；荧光定量RT-PCR；镉；分子标志物

金属硫蛋白(MT)是一类普遍存在于生物体内的低分子量(6～7kDa)、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白,它能广泛地被重金……