刘芙蓉 李彦姝 张红艳 苏楠 李丰

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

刘芙蓉 李彦姝 张红艳 苏楠 李丰＊

(中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室,医学细胞生物学教育部重点实验室,细胞生物学教研室,辽宁沈阳110001)

目的 构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法 以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至p EGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾 HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察p EGFP-SCG10在 HEK293细胞内定位。结果SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体p EGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。p EGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论 成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,p EGFP-SCG10蛋白主要定位于 HEK293细胞浆内。

SCG10; Western blot; 质粒构建

SCG10(Superior cervical ganglion-10)是磷酸化蛋白stathmin家族成员之一,在脑组织发育[1]、微管运动和信号转导中均有重要的作用,在神经元生长和骨形成中也有调节作用。SCG10也称stathmin2,是特异的神经元标志蛋白和潜在的微管失稳因子[2]。虽然在成人脑组织中SCG10的表达水平低,但在发育的中枢神经系统中SCG10高度表达。

SCG10编码序列全长561bp,187个氨基酸,N-末端的定向序列调节它向轴突和树突生长点的运输,主要蓄积于生长锥中心区域(该区域含大量动态微管)。SCG10是通过神经元生长锥的微管失衡活化来调节神经元生长的主要调节子,能增加轴突和树突顶端的能动结构。轴突的延伸、分支和生长锥的伸展是随细胞骨架蛋白连续重组来完成的,其中微管是重要的组成部分。……