刘保生，闫潇娜，杨超，张彦青，吕运开

（河北大学化学与环境科学学院药物化学与分子诊断教育部重点实验室，河北保定 071002）

诺氟沙星与氧氟沙星同时与牛血清白蛋白分子作用的荧光光谱

刘保生，闫潇娜，杨超，张彦青，吕运开

（河北大学化学与环境科学学院药物化学与分子诊断教育部重点实验室，河北保定 071002）

氧氟沙星（OFX）、诺氟沙星（NOR）皆能使牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭.当2种药物共存时可进一步使BSA荧光猝灭，借此利用荧光光谱法研究了诺氟沙星、氧氟沙星药物间的相互作用.研究结果表明2种药物间存在相互作用，使药物与蛋白的结合稳定性减小；BSA的荧光猝灭属于静态猝灭，药物与BSA结合位点数n近似为1.依据Förster能量转移理论，测定了药物与蛋白之间的结合距离r，结果表明：药物间相互作用的存在使r值增大，药物与蛋白结合稳定性减小.荧光同步光谱研究表明药物间的相互作用影响了BSA构象，使BSA分子伸展，疏水性降低.

诺氟沙星；氧氟沙星；牛血清白蛋白；荧光光谱；相互作用

血清白蛋白是最重要的药物分子载体［1］.药物进入人体后，部分药物将与血浆中白蛋白发生可逆的结合反应，而只有处于游离态的药物才可以到达作用部位与受体反应进而产生药理作用，达到治病的效果.因此，研究药物与血清蛋白的作用机理，有助于从分子水平上掌握和了解药物在体内作用过程.诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）均属于第3代喹诺酮类抗菌药［2］.NOR对革兰氏阴性菌、金黄色葡萄球菌有很强的杀菌作用.OFX通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发挥作用，由于其独特的作用机理，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，对革兰氏阴性菌、阳性菌群均有较强的抗菌作用.NOR［3］，OFX［4］与白蛋白的作用及OFX、环丙沙星同时与白蛋白的作用［5］研究已有报道.已有的BSA与药物相互作用的研究［6－7］大多是研究一种药物与蛋白的反应.NOR，OFX属于同一类药物，临床上经常合用，因此研究联合用药的药物间相互影响就显得尤为重要.本文研究氧氟沙星、诺氟沙星在BSA存在时的相互作用，对临床上的合理用药有一定的理论指导意义.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

RF－540型荧光光度计（岛津公司）；UV－265型紫外光度计（岛津公司）；ZD－2型酸度计（上海雷磁仪器厂）.

诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）标准品由天津一方科技有限公司提供，质量分数≥99%，均配成1.0× 10－3mol／L的水溶液；牛血清白蛋白（BSA）标准品由Sigma公司提供，质量分数≥99%，配成1.0×10－4mol／L的水溶液，临用时稀释；Tris－HCl（Tris：分析纯，上海化学试剂采购站经销；HCl：天津市华东试剂厂）缓冲溶液p H＝7.40，0.1 mol／L NaCl（分析纯，秦皇岛市化工厂）溶液（用以维持生理条件下的离子强度）.实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1）于10 m L比色管中准确加入NaCl 1.0 m L，Tris－HCl 2.0 m L，1.0×10－5mol／L的BSA 1.0 m L和不同浓度的NOR或OFX，以水定容，静置30 min，于λex／λem＝286 nm／340 nm时测定体系的荧光光谱或体系的荧光强度F.

2）于10 m L比色管中准确加入NaCl 1.0 m L，Tris－HCl 2.0 m L，1.0×10－5mol／L的BSA 1.0 m L及1.0×10－5mol／L的NOR（或OFX）溶液1.0 m L，再加不同浓度的OFX（或NOR），用水定容，放置约30 min，测定（条件同上）.

2 结果与讨论

2.1 BSA荧光的猝灭

NOR，OFX与BSA及药物－BSA体系的荧光光谱，见图1、2，由图1、2可知，随药物浓度的增大，BSA的荧光强度逐渐减小，表明药物能够猝灭BSA的荧光［8］.依Stern－Volmer方程［9］F0／F＝1＋K sv［Q］＝1＋Kqτ［Q］（F，F0分别为有、无猝灭剂时的荧光强度；τ≈10－8s为大分子荧光平均寿命；K sv为Stern－Volmer猝灭常数；［Q］为猝灭剂的浓度处理数据，结果见表1.速率猝灭常数K q值远大于最大扩散碰撞猝灭常数2.0× 1010L／（mol·s），表明荧光猝灭不是由碰撞引起的动态猝灭，而是生成化合物的静态猝灭［10］.静态猝灭荧光强度的变化规律lg［（F0－F）／F］＝nlgK＋nlg｛［Q］－（F0－F）［P］／F0｝［11］，其中［P］为BSA总浓度；K为结合常数；n为结合位点数.以lg［（F0－F）／F］对lg｛［Q］－（F0－F）［P］／F0｝作图，由其斜率、截距，可以求得NOR，OFX与BSA的K及n，列于表1.由表1可知：各体系n≈1；BSA－OFX体系结合常数大于BSA－NOR体系结合常数，表明OFX－BSA体系稳定性比NOR－BSA体系的稳定性要强；固定NOR用量，按实验方法考察NOR存在时OFX－BSA体系结合常数的变化，发现BSA－NOR－OFX比BSA－OFX体系结合常数小，表明OFX与NOR存在相互作用，作用结果使OFX与BSA的结合能力减弱，即NOR的存在使游离的OFX增加；同理比较BSA－OFX－NOR，BSA－NOR体系结合常数，也表明OFX的存在可以使NOR－BSA的稳定性减弱.体系稳定性减弱表明OFX与NOR共存时，两者产生的相互作用对药物药效有一定程度的影响.

图1 BSA－OFX体系荧光猝灭光谱Fig.1 Quenching fluorescence spectra of BSA－OFX

图2 BSA－OFX－NOR荧光光谱 Fig.2 Fluorescence spectra of BSA－OFX－NOR

表1 药物与BSA的猝灭反应参数Tab.1 Quenching reactive parameters of BSA and drugs

2.2 荧光给体与受体间结合距离的求取

据Förester能量转移理论计算能量转移参数，计算过程见文献［12］，重叠光谱见图3.计算结果列于表2.BSA的荧光主要来自其212位色氨酸残基（Trp）［13］，Trp位于BSA的疏水腔内，r值表示药物与蛋白结合部位与Trp间的距离.OFX，NOR脂溶性较弱，不易进入疏水腔，结合位置距Trp较远，因此，其r值比疏水性药物川穹嗪的r值1.8 nm［14］要大.同时r（BSA－NOR－OFX）＞r（BSA－OFX），表明NOR使BSA－OFX体系稳定性减小，由r（BSA－OFX－NOR）＞r（BSA－NOR）也可得同样的结论.这也证明2种药物共存时存在相互作用.

表2 药物－BSA间E，J，R0，r参数Tab.2 Parameters of E，J，r，R0 between drugs－BSA

图3 BSA，BSA－OFX的荧光光谱及NOR的吸收光谱Fig.3 Fluorescence for BSA，BSA－OFX and absorbance of NOR

2.3 药物对BSA构象的影响

对于BSA的同步荧光光谱，固定发射与激发波长差15，60 nm时分别只显示酪氨酸残基（Tyr）和色氨酸残基（Trp）的荧光特性.Trp的发射波长随Trp所处环境疏水性降低将逐渐红移，据此可以用来推断BSA构象的变化［15］，见图4，红移数据列于表3.表3数据表明NOR，OFX主要分别影响Trp和Tyr，微环境的变化使BSA腔内疏水性降低，肽链的伸展程度有所增加［16］.由图4比较BSA－NOR－OFX与BSA－OFX体系，进一步证明药物间存在相互作用.

表3 体系同步荧光光谱位移数据Tab.3 Date of synchronous fluorescence spectra

图4 BSA－NOR，BSA－OFX－NOR同步荧光光谱Fig.4 Synchronous fluorescence of BSA－NOR and BSA－OFX－NOR

3 结论

实验表明，利用光谱法，通过研究药物与BSA间结合参数的变化可以证明诺氟沙星与氧氟沙星间存在相互作用，使得药物与蛋白的结合稳定性减小，将对药物在体内的代谢和分布产生重要影响.该方法快速、简单，能够为药物的药理研究及临床联合用药提供一定的理论依据.

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Studies on the Interaction Between Norfloxacin and Ofloxacin in Presence of Bovine Serum Albumin by Fluorescence Spectrum Methods

LIU Bao－sheng，YAN Xiao－na，YANG Chao，ZHANG Yan－qing，LÜYun－kai
（Key Laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis，Ministry of Education，College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

Both ofloxacin（OFX）and norfloxacin（NOR）can quench fluorescence of bovine serum albumin（BSA）.The fluorescence will quench further when two drugs coexist.According to this，studies on the interaction between NOR and OFX are established by fluorescence spectrum.Results showed that the interaction between the two drugs could reduce the binding stability of the protein and drug.It confirmed that the quenching mechanism of the combination between BSA and drugs was a static process，and the number of binding sites was 1.Based on the theory of Förester spectroscopy energy transfer，the binding distance（r＜7.0 nm）between drugs and BSA was obtained.The correlation coefficient and binding distance were increased because of the existence of interaction between drugs.Studies utilizing synchronous spectra showed that the conjugation reaction between drugs and BSA would affect the conformation of BSA.It made protein molecules extend and hydrophobic nature reduce.

norfloxacin；ofloxacin；bovine serum albumin；fluorescence spectra；interaction

O 657.32

A

1000－1565（2011）03－0262－05

2010－10－30

国家自然科学基金资助项目（20675024）；河北省重点基础研究项目（10967126D）

刘保生（1963－），男，河北保定人，河北大学研究员，主要从事分子光谱研究.

E－mail：lbs＠hbu.edu.cn

梁俊红）