薛东波 吕明 路广海 张伟辉 潘尚哈

·论著·

急性胰腺炎胰腺腺泡细胞不同死亡方式与细胞内酶释放的关系

薛东波 吕明 路广海 张伟辉 潘尚哈

目的观察轻重程度不同的体外急性胰腺炎(AP)胰腺腺泡细胞发生凋亡、胀亡的状况及细胞内酶的释放情况，探讨两者的关系。方法以两步酶消化法分离胰腺腺泡细胞，分为4组。AP组加入雨蛙素0.1 μg/ml，细菌脂多糖(LPS)组加入雨蛙素及LPS(10 mg/L)，奥曲肽(OCT)组加入雨蛙素及OCT(100 ng/ml)，对照组加培养液。应用丫碇橙(AO)和溴乙锭(EB)双染色法检测腺泡细胞的凋亡及胀亡，采用比色法检测培养上清中淀粉酶及乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果对照组、AP组、LPS组、OCT组的细胞凋亡指数分别为2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；胀亡指数分别为3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4；LDH的分泌量分别为(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分别为(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP组、LPS组、OCT组的上述4项指标均显著高于对照组(P值均<0.05)；LPS组的胀亡指数及LDH和淀粉酶分泌量均较AP组显著增加(P值均<0.05)，而凋亡指数则较AP组显著减少(P<0.05)；OCT组的凋亡指数较AP组显著增多(P<0.05)，而胀亡指数及LDH、淀粉酶分泌均较AP组显著减少(P值均<0.05)。结论诱导AP胰腺腺泡细胞凋亡，并减少细胞胀亡的发生，可减少腺泡细胞内酶的释放。

胰腺炎； 细胞死亡； 细胞凋亡； 淀粉酶类

急性胰腺炎(AP)的发病机制至今尚未完全阐明。目前认为，炎症性细胞因子在其中起着重要作用，而受损的胰腺腺泡细胞所释放的细胞内酶及炎症介质等是此后细胞因子级链反应的触发剂，因此，如何抑制炎症反应的启动成为减轻AP病变的关键。已知胰腺腺泡细胞内容物的释放是影响炎症反应严重程度的关键因素，那么，影响胰腺腺泡细胞内容物释放的因素又是什么呢？本研究以不同药物制备轻重程度不同的AP模型，通过离体实验观察胰腺腺泡细胞凋亡、胀亡状况及细胞内酶的释放情况。

材料与方法

一、胰腺腺泡细胞的分离及分组

取体重(200±20)g雄性Wistar大鼠(清洁级，黑龙江省药品检验所提供)的胰腺组织，剪碎至1.0 mm3大小，浸于消化液[10 mmol/L HEPES(Amresco, USA)、0.5 mg/ml胶原酶V(Sigma,USA),0.5 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Amresco, USA),Eagle′s MEM (Gibco, USA)林格液]中，37℃水浴振荡孵育20 min，同时充以纯氧。更换消化液后再次消化20 min，用250 μm不锈钢网过滤，HEPES-林格液洗涤，200×g离心3 min，共2次。将沉淀的腺泡细胞混悬于培养液中(以10%FBS代替胶原酶V,余同消化液)培养2 h，镜下观察。

调整细胞密度为1×105/ml个，接种于6孔培养板中，每孔 2 ml。AP组加入终浓度为0.1 μg/ml的雨蛙素(Sigma，USA)；细菌脂多糖(LPS)组加入终浓度为10 mg/L的LPS(Sigma，USA)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；奥曲肽(OCT)组加入终浓度为100 ng/ml的OCT(Novartis，Swiss)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；对照组加入等量培养液。每组设5个复孔。置37℃、5% CO2培养箱中培养16 h，分别收集腺泡细胞及培养上清液。

二、细胞凋亡与细胞胀亡的检测

收集各组胰腺腺泡细胞，分别采用丫碇橙(AO，10 μg/ml，Sigma，USA)和溴乙锭(EB，10 μg/ml，Sigma，USA)染色10 min。甩片后在荧光显微镜(Nikon, Japan)下计数500个细胞，计算凋亡指数及胀亡指数。

三、培养上清中淀粉酶及乳酸脱氢酶(LDH)检测

分别离心收集各组培养上清液，应用胰淀粉酶检测试剂盒及LDH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测淀粉酶及LDH含量，按说明书操作。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺腺泡细胞的死亡方式

AO染色后，正常细胞胞核被绿染，形态正常；凋亡细胞胞核也被绿染，但核皱缩、浓集、分裂。EB染色后，正常及凋亡细胞的完整细胞膜拒染；胀亡细胞的胞核被染为桔红色(图1)。对照组、AP组、LPS组、OCT组的细胞凋亡指数分别为2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；胀亡指数分别为3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4。AP组、LPS组、OCT组细胞的凋亡指数及胀亡指数均显著高于对照组(P值均<0.05)；LPS组的胀亡细胞数较AP组显著增多(P<0.05)，而凋亡细胞数则显著减少(P<0.05)；OCT组的凋亡细胞数较AP组显著增多(P<0.05)，而胀亡细胞数则显著减少(P<0.05)。

二、离体胰腺腺泡细胞LDH及淀粉酶的分泌量

对照组、AP组、LPS组、OCT组细胞LDH的分泌量分别为(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分别为(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP组细胞LDH及淀粉酶的分泌量显著高于对照组(P值均<0.05)；LPS组细胞LDH及淀粉酶的分泌量又显著高于AP组(P值均<0.05)；而OCT组细胞的LDH及淀粉酶分泌量均显著低于AP组(P值均<0.05)。

图1胀亡(红箭头)和凋亡(绿箭头)的胰腺腺泡细胞(AO和EB双染色 ×40)

讨 论

凋亡和胀亡代表了两种不同的细胞死亡方式[1]。自从1972年Kerr提出细胞凋亡的概念以来，学术界对细胞凋亡进行了较深入的研究。近几年人们才开始关注胀亡，并逐渐认识到胀亡的意义并不亚于凋亡。细胞胀亡是细胞肿胀，细胞膜完整性破坏，DNA裂解为非特异性片段，最后细胞溶解并伴有炎症反应的细胞死亡过程。在某些生理或病理过程中，两种死亡方式同时存在，并在一定条件下可以相互转换。Andersson等[2]认为，AP时细胞胀亡的发生和程度决定了AP的病变严重程度。腺泡细胞若以胀亡方式死亡则会释放各种胰酶、炎症介质,并由此引起多种炎症细胞聚集，诱发强烈的炎症反应；若以凋亡方式死亡，因为细胞膜保持完整，不伴炎症介质、胰酶释放，故炎症反应较轻[3]。因此，如果我们能够诱导AP时的胰腺腺泡细胞发生凋亡，并减少胀亡，则有可能抑制超强炎症反应的启动及其引发的全身炎症反应综合征(SIRS)及多器官功能不全综合征(MODS)。

LPS(又称为脂多糖)是革兰阴性杆菌(G-)外膜的主要成分。有研究表明，肠源性内毒素血症可以促使急性水肿型胰腺炎向急性坏死型胰腺炎发展[4]，其可能的作用机制是内毒素上调细胞黏附分子，促进中性粒细胞大量聚集，并释放许多细胞因子造成组织损伤。OCT是人工合成的生长抑素八肽，被广泛用于AP的治疗[5]，其主要作用是抑制胰酶分泌，但近来人们发现其有诱导胰腺腺泡细胞凋亡的作用[6-7]。本实验采用雨蛙肽制备体外AP模型。在此基础上，再以LPS刺激制备重度AP模型，以OCT刺激制备轻度AP模型。结果显示，以雨蛙肽刺激制备的AP模型用LPS处理后，凋亡细胞数减少，胀亡细胞数增加；而用OCT处理后，凋亡细胞数增加，胀亡细胞数减少。

胀亡细胞由于存在细胞膜缺陷，细胞内物质可释放到细胞外；正常及凋亡细胞由于细胞膜完整，无此现象[8]。本实验结果显示，以雨蛙肽刺激制备的AP模型的腺泡细胞用LPS处理后LDH及淀粉酶释放量增高；而用OCT处理后LDH及胰淀粉酶释放量明显下降，表明诱导凋亡、抑制胀亡后，减少了细胞内酶的释放。故抑制细胞胀亡、诱导细胞凋亡可能成为治疗AP的新的思路。

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[2] Andersson R,Wang X.Patterns of pancreatic cell death:apoptosis versus oncosis.Pancreas,1998,17:281-288.

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[4] Li YY,Ochs S,Gao ZR,et al.Regulation of HSP60 and the role of MK2 in a new model of severe experimental pancreatitis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2009,297:G981-G989.

[5] Kisli E,Baser M,Aydin M,et al.The role of octreotide versus placebo in the prevention of post-ERCP pancreatitis.Hepatogastroenterology,2007,54:250-253.

[6] Zhang XP,Zhang L,He JX,et al.Experimental study of therapeutic efficacy of Baicalin in rats with severe acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2007,13:717-724.

[7] 袁耀宗,龚自华,楼恺娴,等.生长抑素及Octreotide对急性胰腺炎胰腺细胞凋亡的作用机制.中国危重病急救医学,2000,12:402-404.

[8] Willems L,Zatta A,Holmgren K,et al.Age-related changes in ischemic tolerance in male and female mouse hearts.J Mol Cell Cardiol,2005,8:245-256.

2010-10-15)

(本文编辑：屠振兴)

ObjectiveTo observe the apoptosis or oncosis of pancreatic acinar cells of different severity of acute pancreatitis (AP) and the release level of enzymes in vitro, and to investigate the relationship between them.MethodsTwo-step enzymatic digestion method was used to separate pancreatic acinar cells into 4 groups. 0.1 μg/ml of the caerulein was added in the AP group. Caerulein and LPS (bacterial lipopolysaccharide, 10 mg/L) were added in LPS group. Caerulein and OCT (octreotide, 100 ng/ml) were added in OCT group. Medium was added in the control group. AO (acridine orange) and EB (ethidium bromide) double staining method was used to detect the incidence of apoptosis or oncosis of acinar cell. The release of intracellular enzyme was detected by measuring the concentrations of amylase and LDH in cell culture media by colorimetry method.ResultsThe apoptosis index was 2.2±0.4, 6.4±0.6, 4.6±0.4, 11.2±1.2 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; while the oncosis index was 3.0±0.4, 17.2±1.6, 23.0±2.2, 12.8±1.4 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; the release of LDH was (2180±240), (8060±930), (9460±920), (6860±740)U/dl, the level of amylase was (1750±190), (3820±460), (4420±480), (2260±260)U/L. All the values in the experiment groups were significantly higher than that in control group (P<0.05). The oncosis index, LDH, amylase in LPS group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the apoptosis index in LPS group was significantly lower than that in AP group (P<0.05). The apoptosis index in OCT group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the oncosis index, LDH, amylase was significantly lower than that in AP group (P<0.05).ConclusionsInduction of apoptosis and reduction of oncosis in AP pancreatic acinar cells can reduce the release of enzyme in acinar cells.

Pancreatitis; Cell death; Apoptosis; Amylases

RelationshipbetweendifferentdeathwaysofpancreaticacinarcellsandreleaseofintracellularenzymesinacutepancreatitisXUEDong-bo,LÜMing,LUGuang-hai,ZHANGWei-hui，PANShang-ha.DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.016

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11531157)

150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院普外科(薛东波、路广海、张伟辉、潘尚哈)；美国加利福尼亚大学洛杉矶分校David Geffen医学院外科系(吕明)