陈 睿，储忠英，张继春，田 兰

(上海市松江食品药品检验所，上海 201600)

·药物分析·

UPLC-MS/MS检测镇静安神类中成药中违禁添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑

陈 睿，储忠英，张继春，田 兰

(上海市松江食品药品检验所，上海 201600)

目的建立镇静安神类中成药中添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑的专属检测方法。方法采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱，C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈(90:10)梯度洗脱，流速0.4 ml/min,检测波长254 nm；离子源为ESI源，正离子检测，对中成药中添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑定性、定量检测。结果地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑线性范围分别为109.8～878.4、102.1～816.8、106.9～855.2 ng/ml，地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑的检出限为分别0.06、2.5×10-3、2.8×10-3ng，定量限分别为0.19、8.2×10-3、9.2×10-3ng ，3种药物平均回收率在95.7%～103.7%之间。结论本方法选择性强、灵敏度高、处理方法简单，测定快速，可用于镇静安神类中成药中添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑的测定。

超高效液相色谱-串联四级杆质谱；中成药；镇静安神类；违禁添加物

中成药中非法添加化学药物不仅使中成药原有的药效可能发生改变，同时也使患者的用药安全得不到应有的保障[1]。镇静安神类中成药使用普遍，更容易使不法分子非法添加镇静催眠类化学药，此类药物有成瘾性，长期使用容易对其产生依赖性,且该类药物的半衰期很长，达50 h，若随意服用会使人昏沉，严重影响工作和生活。本实验选择了地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑三种易被非法添加的药物为检测对象。目前测定这三种化学药物的方法有薄层色谱法、HPLC-MS/MS法分别测定[2]。本法建立了UPLC-MS/MS同时检测镇静安神类中成药中添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑，灵敏度高、选择性强、准确快速。为强有力打击制假售假违法者提供技术保障和科学依据。

1 仪器与试药

Waters ACQUITY UPLC Quattro MicroTM超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪，MassLynx4.1质谱工作站。对照品地西泮(批号：171225-200302)、氯硝西泮(批号：171227-200302)、艾司唑仑(批号：1219-0102)均由中国药品生物制品检定所提供。样品由药监分局监督抽验。乙腈为色谱纯，购自Merk公司，乙酸铵选用进口色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为10 mmol/L乙酸铵溶液，按表1进行梯度洗脱，流速ml/min，检测波长254 nm，进样量10 μl，柱温为35 ℃。

表1 梯度洗脱表

2.2质谱条件 Quattro MicroTM三重四级杆质谱，离子化模式为ESI+，检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3 KV；脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量600 L/h ;锥孔反吹气30 L/h 。锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 质谱参数

2.3质谱分析及定性、定量 以电喷雾离子化方式对地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑标准溶液进行MS扫描，经试验，3种化合物均在正离子检测方式下具有较高的灵敏度，因此采用正离子检测的方式进行LC-MS/MS分析。定性鉴别时，以化合物的保留时间及离子对进行确认。定量测定时以定量离子对的响应做外标法进行定量分析。3种化合物的总离子流图(TIC)见图1。

图1 3种化合物的总离子流图

1-硝西泮; 2-艾司唑仑; 3-地西泮

2.4混合标准储备液的制备 精密称取经60 ℃减压干燥的对照品地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑适量，用流动相溶解并制成每ml含有1 μg的标准储备液并保存于冰箱中。

图2 三种化合物二级质谱图

A-地西泮; B-氯硝西泮; C-艾司唑仑

2.5供试品溶液的制备 取供试品细致研磨粉碎，取约0.3 g，精密称定，置于50 ml量瓶中，加流动相约45 ml，超声提取10 min，放冷至室温，加入流动相溶液稀释至刻度，摇匀，经过夜沉淀后取上层溶液适量，高速离心(不小于105/min)，取上清液用流动相溶液稀释10～100倍，即可。

2.6线性关系考察 分别精密吸取“2.4”项下标准储备液适量，用流动相稀释成100、200、400、500、600、800、1 000、1 500 μg/L的混合标准系列浓度液，进行LC-MS/MS测定。以化合物定量离子对的峰面积(Y)对相应的浓度(X)进行线性回归，见表3。

2.7重复性试验 取800 μg/L混合标准溶液在拟定的UPLC-MS/MS条件下连续测定6次，由地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑定量离子对峰面积计算精密度，RSD(%)分别为1.2、1.0、 0.6 (n=6)。

表3 3种化合物线性关系

2.8日间精密度试验 在连续3 d内配制含各对照品浓度为500、1 000、1 500 μg/L的加标样品，在拟定的UPLC-MS/MS条件下，在同一天内每个浓度重复测定2次，由地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑定量离子对峰面积计算，RSD(%)分别为2.4、1.5、 0.68 (n=6)。

2.9检测限和定量限 取混合对照品储备液，用流动相稀释成一定浓度的溶液后测定各化合物的信噪比，依据检出限为3倍信噪比(S/N=3)，定量限为10倍信噪比(S/N=10)，分别得出各化合物的检测限：地西泮0.06 ng、氯硝西泮2.5×10-3ng，艾司唑仑2.8×10-3ng。定量限：地西泮0.19 ng、氯硝西泮8.2×10-3ng，艾司唑仑9.2×10-3ng。

2.10稳定性试验 取800 μg/L混合标准溶液，分别在配制后于室温下放置0，3，6，12，18，24 h时测定，根据地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑定量离子对峰面积计算精密度，RSD(%)分别为1.0、0.9、 0.7(n=6)，结果表明3种化合物在24 h内基本稳定。

2.11加样回收率试验 精密称取阴性样品适量于50 ml量瓶中，精密加入混合对照品储备液适量，按照2.5项下方法制备，使终浓度分别为500、 1 000、1 500 μg/L，根据外标法计算3种化合物的平均回收率。结果见表4。

表4 3种化合物的平均回收率

2.12样品测定 样品按“2.5”项下方法制备，在拟定的UPLC-MS/MS条件下测定，结果21批抽验样品均无非法添加。

3 讨论

3.1由于中药成分的复杂性，故有必要采用高选择性的分析手段。本法可快速、准确地对中药制剂中非法添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑同时进行检测，专属性强，3种化合物可达基线分离，分离速度快。

3.2色谱条件的选择：本法建立了镇静安神类中成药中非法添加地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑的专属检测方法。流动相的配比及洗脱方式直接影响化合物分离，本实验在建立方法时分别采用等度洗脱和梯度洗脱的方法进行比较，结果梯度洗脱分离速度明显比等度洗脱快，因此采用10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈(90:10)梯度洗脱。

3.3质谱条件的选择：本方法分析的3个都是碱性化合物，故选用离子化模式为ESI+。

3.4溶剂选择：本法以流动相制得供试品和对照品溶液，分析结果表明其色谱峰和质谱图均良好，保留时间重复性好。

3.5实验结果表明，流动相的纯度是影响质谱检测的重要因素，本实验对乙腈及纯化水的选择进行了优化。

[1] 李欣荣,陈安珍,杨 钊.UPLC-MS/MS检测消肿止痛类中成药中违禁添加的双氯芬酸钠和氨基比林[J].药物分析杂志，2010，30(7): 1294.

[2] 国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件汇编[S].批准件编号2006008:109； 2006024:139.

2010-12-22

[修回日期] 2011-05-23

DeterminationofforbiddenadditiondrugsofDiazepam，ClonazepamandEstazolamintranquilizingmindtraditionalChinesemedicinebyUPLC-MS/MS

CHEN Rui，CHU Zhong-ying，ZHANG Ji-chun，TIAN Lan

(Shanghai Songjiang Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201600,China)

ObjectiveTo establish a specific method for determination of forbidden addition drugs of Diazepam，Clonazepan and Estazolam in tranquilizing mind Traditional Chinese Medicine.MethodsDiazepam, Clonazepam and Estazolam were determined and analyzed by UPLC-MS/MS. ACQUITY BEH C18analysis column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) was used with the mobile phase of 10 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile(90:10) with gradient elution. The flow rate was 0.4 ml/min，and the detection wavelength was 254 nm.EIS ion source was used with positive ion monitoring．ResultsThe standard curves of Diazepam，Clonazepam and Estazolam showed good linearity over the concentration rang of 109.8～878.4, 102.1～816.8,106.9～855.2 ng/ml，The detection limits were 0.06,2.5×10-3,2.8×10-3ng，the quantitation limits were 0.19,8.2×10-3,9.2×10-3ng，the average recoveries of three chemicals was 95.7%～103.7%.ConclutionThe method was specific,sensitive，easily and quickly，which could be used to detect Diazepam，Clonazepan and Estazolam in tranquilizing mind traditional Chinese medicine．

UPLC-MS/MS；traditional Chinese medicine；tranquilizing mind；addition drugs

陈 睿(1966-)，女，副主任药师.Tel:(021)57820190,E-mail:xiaoxi68cr@163.com.

R917

A

1006-0111(2011)06-0457-03