郝宝成 梁剑平 兰喜 刑小勇 项海涛 温峰琴 胡永浩 柳纪省

摘要：为了提高猪戊型肝炎病毒ｓｗＣＨ１８９株衣壳蛋白基因ＣＰ２３９片段在大肠杆菌中的表达量，研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂ＩＰＴＧ浓度等不同条件对衣壳蛋白基因ＣＰ２３９片段融合蛋白表达量的影响。结果表明，用ＬＢ培养基于３７ ℃培养３．５ ｈ后，采用终浓度为０．３ ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ诱导培养４ ｈ，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白表达量最大；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的分子质量与预期大小一致，约为４５．３ ｋｕ；Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting结果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以与抗－ＨＥＶ阳性血清发生特异性反应，并具有良好的反应原性，说明衣壳蛋白基因ＣＰ２３９片段蛋白得到正确表达。

关键词：猪戊型肝炎病毒；衣壳蛋白；ＣＰ２３９片段；原核表达

中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3116-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｉｎ ｔｈｅ ｓｗＣＨ１８９ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Vｉｒｕｓ

ＨＡＯ Ｂａｏ－ｃｈｅｎｇ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ１，３，ＬＡＮ Ｘｉ２，ＸＩＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ３，ＸＩＡＮＧ Ｈａｉ－ｔａｏ３，ＷＥＮ Ｆｅｎｇ－ｑｉｎ３，

ＨＵ Ｙｏｎｇ－ｈａｏ３，ＬＩＵ Ｊｉ－ｘｉｎｇ２，３

（１． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０，Ｃｈｉｎａ；２． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｐｌａｎｔ－ｅａｔｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To improve ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｇｅｎｅｓ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ ｓｗＣＨ１８９ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．， ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｒｏｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ， ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ was ａｎａｌｙｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｗａｓ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ３．５ ｈ ｗｉｔｈ ＬＢ ａｔ ３７ ℃ ａｎｄ ４ ｈ ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ａｔ ３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ４５．３ ｋｕ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ａｎｔｉ－ＨＥＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ wｏｒｄｓ： sｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ； cａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ； pｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

戊型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ，ＨＥＶ）过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒。Ｂａｌａｇａｎ等［１］用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为２７～３０ ｎｍ的病毒样颗粒，从而证实该病毒为新型的肝炎病毒，并对人类健康具有严重的危害性。ＨＥＶ基因组为单股正链ＲＮＡ，约７．３ ｋｂ，具有３个开放读码框（ＯＲＦ）。病毒基因组的５′端到３′端依次为５′端非编码区、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ２、３′端非编码区及ｐｏｌｙＡ 尾。

ＨＥＶ ＯＲＦ２编码蛋白（ＰＯＲＦ２）抗原表位数量多，结构复杂，除Ｎ端２５－３８ ａａ外，大多数分布在Ｃ端２／３部分，包括了ＰＯＲＦ２ ２５－３８ ａａ、３１９－３４０ ａａ、３４１－３５４ ａａ、３９０－４７０ ａａ、４２２－４３７ ａａ、５１７－５３０ ａａ、５４６－５８０ ａａ、６３１－６４８ ａａ、６４１－６６０ ａａ等９个抗原活性区，研究还证实在３９４－４７０ ａａ之间至少含有５个不同免疫活性的抗原表位［２－４］。本试验利用ｐｒｏｔｅａｎ软件对ＨＥＶ ｓｗＣＨ１８９株的ＯＲＦ２进行潜在抗原位点分析。在ＯＲＦ２ Ｃ端２／３处选取ＣＰ２３９片段（３８１－６２３ ａａ）进行了原核表达，在克隆和表达了ＣＰ２３９片段的基础上对其表达条件进行了优化，以期获得最大产量的融合蛋白用于建立快速诊断方法。

１材料与方法

１．１病毒株

经ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＥＶ ＲＮＡ为阳性的ｓｗＣＨ１８９株，由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病实验室保存。

１．２菌种和载体

菌种为大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，表达菌Rｏｓｅｔｔａ及表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病实验室保存。克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ载体购自大连宝生物工程公司。

１．３试剂

辣根过氧化物酶标记的羊抗猪ＩｇＧ抗体、ＤＡＢ为鹏程公司产品。ＲＮａｓｅ、低分子蛋白质Ｍａｒｋｅｒ、琼脂糖购自联创公司。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 蛋白Ｍａｒｋer购自鹏程公司。其余试剂均为分析纯或生化试剂。

１．４融合蛋白的诱导表达

含ＣＰ２３９基因的重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９和ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ３２ａ空载体分别导入表达受体菌Ｒｏｓｅｔｔａ中，挑取单菌落于３７ ℃培养至ＯＤ６００nm≈０．６，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导一定时间，并以空菌、空载体和未加ＩＰＴＧ的培养物作为对照；菌体离心后弃上清液，沉淀重悬于１０ ｍＬ含２％ ＤＯＣ的细菌裂解液，振荡混匀，室温放置１５ ｍｉｎ，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。取沉淀再重复上述步骤２次，上清液均留样。使用最小体积的４ mol/L的尿素将沉淀溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ。沉淀中若仍有透明未溶解物质，再用８ mol/L的尿素溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃沉淀。重悬后加入２倍ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上样缓冲液混匀，沸水煮５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ/ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ后取上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测，鉴定目的基因的表达情况。

１．５融合蛋白的鉴定

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌotting鉴定融合蛋白，即样品经１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后，按Ｂｉｏ．Ｒａｄ湿转使用说明将蛋白转至硝酸纤维素膜上，２００ ｍＡ，１０５ ｍｉｎ完成湿转。用５％牛血清３７ ℃封闭液室温封闭２ ｈ。将硝酸纤维素膜放入干净的塑料袋中，加用封闭液稀释的人抗－ＨＥＶ阳性血清（１ ０００倍稀释），封闭塑料袋，室温摇摆平台过夜。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ。加入用封闭液以１ ０００倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪ＩｇＧ抗体，室温温育２ ｈ。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ，ＡＥＣ（３－氨基－９－乙基卡唑，３－ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｚｏｌｅ）显色１５ ｍｉｎ，用滤纸吸干膜上残余液体，拍照保存。

２结果与分析

２．１不同表达载体对ＣＰ２３９表达量的影响

分别将ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的重组菌１％接种于含氨苄西林抗性的ＬＢ培养基中，３７ ℃ 摇床培养３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入终浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３７ ℃诱导培养４ ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检测结果表明ｐＥＴ３２ａ中ＣＰ２３９表达量较高， ｐＥＴ２８ａ中表达量较低，因此ｐＥＴ３２ａ是比较适合ＣＰ２３９表达的载体。

２．２温度对重组菌生长和ｐＥＴ３２a－ＣＰ２３９表达量的影响

重组菌１％ 接种于含氨苄西林抗性的ＬＢ培养基中，３７ ℃培养３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入终浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，分别在２２、３０、３７ ℃诱导培养４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，３７ ℃时ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表达量最高，30 ℃时表达量稍低，而在２2 ℃时表达量更低。

２．３转速对重组菌生长和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表达量的影响

重组菌１％接种于含氨苄西林抗性的ＬＢ培养基中，３７ ℃培养３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入终浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ， 分别在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ和３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ诱导培养４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检测结果表明，转速对ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的影响很大，３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ诱导培养条件下ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表达量较低。

２．４ＩＰＴＧ使用浓度对重组菌生长和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表达量的影响

ＩＰＴＧ是重组菌表达目的蛋白的诱导剂，将重组菌１％的接种量接种于含氨苄西林抗性的ＬＢ培养基中，３７ ℃培养３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，分别加入不同终浓度的ＩＰＴＧ（０．１、０．３、０．５、０．７、１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，ＩＰＴＧ对ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表达量有明显影响，加ＩＰＴＧ前基本不表达； 在浓度小于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ时表达量较小，在浓度等于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ时能完全表达，在浓度大于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ时也能完全表达，因此，在浓度为０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ时，表达最优（图１）。

２．５ＩＰＴＧ诱导时间对ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表达量的影响

重组菌１％ 接种于含氨苄西林抗性的ＬＢ培养基中，３７ ℃培养３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入终浓度为１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，诱导时间分别从１ ｈ至８ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果表明，ＩＰＴＧ诱导培养４ ｈ时ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表达量较高，大于４ ｈ后表达量已没有明显差别。

２．６Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting鉴定结果

在优化条件下，将含重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ 的大肠杆菌菌株Ｒｏｓｅｔｔａ在３７ ℃培养３．５ ｈ后，使用终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃诱导培养４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，融合后的目的蛋白为单一条带，大小约为４５．３ ｋｕ，与预计的分子质量大小相符合（图２）；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂlotting结果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以与抗－ＨＥＶ阳性血清发生特异性反应，并具有良好的反应原性。

３讨论

大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点［５］，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的３０％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统［６］。

目前人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因，但是由于目的基因结构的多样性及其与大肠杆菌基因的差异，不同的外源基因在表达效率上有很大的差异。表达系统的核心是表达载体。用来在大肠杆菌中表达外源基因的载体有很多种，一般来说，这些载体应满足以下要求：重组质粒拷贝数多，表达量高；适用范围广；表达产物容易纯化；在菌体内稳定性好。不同载体的特点不同，主要的差别有启动子类型、质粒拷贝数、基因本身的因素、密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要，融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。因此在本试验中，通过不同表达载体与宿主菌﹑培养条件适宜的组合来使目的蛋白获得最大量的表达。

从实验结果看温度对目的蛋白表达量的高低影响较小。试验选择３７ ℃作为诱导温度，是因为目的基因在低温时表达稍低，在高温时又常常会使一些蛋白积累形成包涵体［７］。诱导温度对表达量有影响，主要体现在对宿主后续生长的影响上。

异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而且十分稳定，因此ＩＰＴＧ是实验室常用的乳糖操纵子诱导剂，能与ｌａｃ?譙编码的阻遏蛋白特异性结合，使阻遏蛋白构象发生变化，从而诱导Ｔ７启动子驱动重组基因的转录和表达，是一种十分有效的诱导剂［８］。Ｆａｓｓ等［９］早在１９９１年的研究表明ＩＰＴＧ的剂量有一定范围，浓度过低影响目的蛋白的表达，浓度过高则抑制细菌的生长，在培养基中少量存在时就可进入菌体内部发挥作用，是一种非代谢的诱导物。试验采用ＩＰＴＧ作诱导剂，从图１可以看出，ＩＰＴＧ对基因的表达有关键性的影响。与诱导前相比，加入ＩＰＴＧ后目的基因表达条带明显增加，但不同终浓度ＩＰＴＧ对融合蛋白的表达量影响较小。当ＩＰＴＧ浓度增加到１ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表达量较大，继续增加ＩＰＴＧ的浓度，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表达量不增加反而略有下降，这可能是由于较高浓度的乳糖提高了细菌的生长速度，当细菌过快生长时，质粒的拷贝数降低，导致表达量下降。在本试验中ＩＰＴＧ诱导表达的最佳终浓度为０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ。

诱导时间对蛋白表达量有一定影响，诱导时间太短，菌体量少，目的蛋白量也少；诱导时间太长，则菌体老化，酶体系统活性减弱，代谢速度减慢，转录翻译迟钝，不利于目的蛋白的表达。从试验中发现，３７ ℃诱导４ ｈ时ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表达量最大，诱导时间过短蛋白表达量稍低，诱导时间过长，表达量已经恒定，延长时间表达已没有意义，且诱导时间达７ ｈ以上时，蛋白的表达量反而降低。原因可能是由于细菌生长接近饱和而老龄菌体增加所致，有研究报道如果再更换等体积新鲜培养基诱导或可获得更高的蛋白表达量［１０］。

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