王文涛 陈彬 傅筑荫

摘要：采用ＰＣＲ和直接测序的方法测定兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡线粒体ＤＮＡ控制区全序列，分析比较两者ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ序列３个区的变异。结果表明，兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡线粒体ＤＮＡ控制区全序列长分别为１ ２３１和１ ２３０ ｂｐ，其中兴义矮脚鸡ｍｔＤＮＡ控制区的碱基摩尔分数分别为Ａ ２６．９２％、Ｔ ３３．４１％、Ｇ １３．３９％、Ｃ ２６．２９％，长顺绿壳蛋鸡的分别是Ａ ２７．１３％、Ｔ ３３．５８％、Ｇ １３．２０％、Ｃ ２６．０９％。ｔ检验显示两种贵州地方鸡种间线粒体ＤＮＡ控制区碱基Ａ与Ｃ的含量差异显著，说明Ａ与Ｃ之间的颠换较多。兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡的遗传距离是０．０３８ ６，根据分子钟计算，二者大约在１９３万年前分歧进化。

关键词：线粒体ＤＮＡ控制区；兴义矮脚鸡；长顺绿壳蛋鸡；遗传变异

中图分类号：Ｑ３４３．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3114-02

Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Kｉｎｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ

ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｔａｏa，ＣＨＥＮ Ｂｉｎa，ＦＵ Ｚｈｕ－ｙｉｎb

（a． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；

b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＰＣＲ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ ｉｎ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ ｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ． Ｔｈｅ Ｄ－ｌｏｏｐ ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ａｎｄ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ

１ ２３１ ａｎｄ １ ２３０ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｌｏｎｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ molar fraction ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ｗａｓ Ａ ２６．９２％， Ｔ ３３．４１％， Ｇ １３．３９％， ａｎｄ Ｃ ２６．２９％ ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ Ａ ２７．１３％， Ｔ ３３．５８％， Ｇ １３．２０％ ａｎｄ Ｃ ２６．０９％． Ｔｈｅ t－ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａ ａｎｄ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ０．０３８ ６． Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｃｋ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｄｉｖｅｒｇｅｄ ａｎｄ ｅｖolved ａｂｏｕｔ １．９３ ｍｉｌｌｉｏｎ ｙｅａｒｓ ａｇｏ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ； Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ chicken； Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ； gｅｎｅｔｉｃ vａｒｉａｔｉｏｎ

线粒体ＤＮＡ控制区是非编码基因区，在进化过程中受环境的选择压力小，表现出进化速率快和母系遗传等特点，在鸟类的分类研究中常用作种系发生的分子标记［１］。

在漫长的家鸡养殖历史中，贵州形成了丰富的地方鸡品种资源。兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡是两种优良的贵州地方鸡种，近年来由于生存环境遭到破坏、引进外地品种杂交改良等人为因素以及某些自然因素的影响，二者的开发利用受到限制［２，３］。对二者的亲缘关系和起源分化的研究不仅可以弄清它们的亲缘关系状况，为进一步选育和杂交配套提供理论基础，还可探讨人工选择对同一个地理群体遗传分化的影响。本研究通过比较兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡两类群间的ｍｔＤＮＡ序列变异，分析了二者的亲缘关系。

１材料与方法

１．１试验材料

试验用的兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡各为１５个样本。翅静脉采血０．５～１．０ ｍＬ，肝素钠抗凝，４ ℃保存备用。采用ＴＩＡＮａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ试剂盒提取血样中ＤＮＡ，－２０ ℃保存备用。兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡均由贵州大学科研鸡场提供。

１．２ＰＣＲ反应及测序

ＰＣＲ扩增引物为ＰＨＤＬ（５′－ＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴ

ＧＡＡＡＡＧＣ－３′）、ＰＨｌＨ（５′－ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＧ

ＧＡＡＣＣＡＧ－３′）和Ｌ４００（５′－ＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＣＡ

ＣＣＴＣＡＣＧ－３′）、ＰＨＤＨ（５′－ＣＡＴＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧ

ＴＧＣＣ－３′）（引物名称末尾字母L、H分别代表轻链和重链）［４］。２５ μＬ ＰＣＲ反应液中含ＤＮＡ样品２ μＬ，上下游引物各０．８ μＬ，２×Ｔａq ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂１２．５ μＬ，ｄｄ Ｈ２Ｏ ８．９ μＬ。ＰＣＲ循环参数（３０循环）为９４ ℃预变性３ ｍｉｎ，９４ ℃变性３０ ｓ，６１～６３ ℃复性３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，最后７２ ℃延伸４ ｍｉｎ。用２％琼脂糖凝胶检测ＰＣＲ产物。扩增产物经ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ试剂盒回收纯化后由北京诺赛基因组研究中心完成测序。

１．３序列分析

利用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８对原始ＤＮＡ序列进行对位排列，并经人工仔细核查后，利用ＤｎａＳＰ ４．０［５］提取变异位点。利用ＭＥＧＡ ４．０［６］统计碱基组成，并计算基于Ｋｉｍｕｒａ双参数模型的遗传距离。以原鸡为外群（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＢ００７７２０），构建ＮＪ分子系统发生树。

２结果

２．１ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区序列变异

用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８对原始ＤＮＡ序列进行对位排列和剪切对齐后，得到兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡线粒体ＤＮＡ控制区序列全长分别为１ ２３１ ｂｐ、１ ２３０ ｂｐ。与兴义矮脚鸡相比，长顺绿壳蛋鸡ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区全序列在第４４６位点缺失。两者之间共发现 ２３个变异位点，包括１１个转换和１２个颠换，11个转换分别是５次Ｔ－Ｃ间转换，６次Ａ－Ｇ间转换；颠换中，Ａ－Ｔ间２次，Ｇ－Ｔ间１次，Ａ－Ｃ 间８次，Ｇ－Ｃ间１次。

兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区Ⅰ区有１３个变异位点，占总变异数的５６．５％，序列变异率为４．１１％；Ⅱ区有 ２个变异位点，序列变异率为０．４３％；Ⅲ区有８个变异位点，序列变异率为１．７９％。

２．２ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区序列碱基组成

兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡ｍｔＤＮＡ控制区的碱基含量见表１。由表１可见，两种贵州地方鸡Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４种碱基的平均摩尔分数分别为２７．０２％、３３．４９％、１３．２９％、２６．１９％，Ａ＋Ｔ含量高于Ｇ＋Ｃ，这符合鸡ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区是Ａ＋Ｔ富含区、而Ｔ含量最高的特点，表现出ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区碱基组成的偏倚性。ｔ检验显示两种贵州地方鸡种间线粒体ＤＮＡ控制区碱基Ａ与Ｃ的含量差异显著（Ｐ＜０．０５），说明Ａ与Ｃ之间的颠换较多。

２．３系统发生树

基于Ｋｉｍｕｒａ双参数模型计算兴义矮脚鸡与长顺绿壳蛋鸡的遗传距离为０．０３８ ６，两种贵州地方鸡种与原鸡的遗传距离为０．２１０ ６。

依据测定的序列，以原鸡为外群，构建兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡的ＮＪ分子系统发生树（图１）。兴义矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡在系统树上各聚成一支，并且各支的置信度很高，特别是种间的置信度达到９９％。

３讨论

鸟类ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区的进化速率为每百万年２％［７，８］，以此计算兴义矮脚鸡与长顺绿壳蛋鸡的分歧进化时间约为１９３万年。但碱基转换易饱和，因此可用颠换估算二者间的分歧时间。由于没有贵州地方鸡种进化时间参考，我们以石鸡和大石鸡为参照。两种鸡ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ区全序列的颠换数有１０个，其分歧时间约为１９０万年［９］，碱基颠换速率为５．２６个／百万年。兴义矮脚鸡和长顺绿壳蛋鸡间的碱基颠换数为１２个，由此推算二者的分歧时间大约为２２０万年前，属于更新世第二次寒冷期［１０］。贵州地处我国西南地区，可能是更新世第二次寒冷期严重的山脊冰川作用将二者隔离在不同的低地，最终分歧进化成不同的地方鸡种。

参考文献：

［１］ 刘益平，曾凡同，张思婉，等．几种山地乌骨鸡线粒体ＤＮＡ序列多态性分析［Ａ］． 家禽研究最新进展——第十一次全国家禽学术讨论会论文集 ［Ｃ］．北京：中国畜牧兽医学会，２００３．１９８－２０１．

［２］ 潘周雄，张福平，曹娟，等．贵州长顺绿壳蛋鸡简介［Ｊ］．中国家禽，２００８，３０（４）：５３－５４．

［３］ 王文涛，陈彬，傅筑荫，等．贵州地方鸡种资源的现状、存在问题及对策［Ｊ］．贵州农业科学，２０１０，３８（８）：１５５－１５７．

［４］ ＲＡＮＤＩ Ｅ， ＬＵＣＣＨＩＮＩ Ｖ．０ｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｇｅｎｕｓ Ａｌｅｃｔｏｒｉｓ［Ｊ］． Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ，１９９８，４７（４）：４４９－４６２．

［５］ ＲＯＺＡＳ Ｊ， ＲＯＺＡＳ Ｒ． ＤｎａＳＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９９，１５（2）：１７４-１７５．

［６］ ＴＡＭＵＲＡ Ｋ， ＤＵＤＬＥＹ Ｊ， ＮＥＩ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＭＥＧＡ４：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｏｉｌ Ｅｖｏｌ，２００７，２４（8）：ｌ５９６－１５９９．

［７］ ＫＬＢＩＮＳＫＬ D Ｏ Ｆ，GALLAGHER C，EBYNON C M，ｅｔ ａｌ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， １９９４，３６８（６４７４）：８１７－８１８．

［８］ 刘益平，朱庆，曾凡同，等．原鸡线粒体ＤＮＡ部分序列多态性分析［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００４，３５（２）：１３４－１４０．

［９］ 黄族豪，刘迺发，龙进，等．从线粒体ＤＮＡ控制区基因比较石鸡和大石鸡的遗传变异［Ｊ］．２００６，２８（３）：４２０－４２４．

［１０］ 李吉均，文世宣，张青松，等．青藏高原隆起的时代、幅度和形式的探讨［Ｊ］．中国科学，１９７９（６）：６０８－６１６．