赵 丽，赵曙光，李慧艳，唐 华，闻勤生 (第四军医大学唐都医院消化内科，西安 710038;通讯作者，E-mail:wenqsss@yahoo.com.cn.)

近年，非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)发病逐渐增多，已成为全球普遍关注的医学和社会问题。但NASH发病机制尚未完全阐明，缺乏有效的防治措施。有研究［1］显示，NASH患者常有胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，IR是NASH的始动因素而不是结果。高脂饮食引起的氧化应激是引起IR重要因素。氧化应激通过激活多种应激敏感通路引起IR，如jun N－末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)通路活化可增加胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)的丝氨酸磷酸化、抑制胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化，进而抑制胰岛素信号通路转导产生IR。目前认为Nrf2激活是细胞抗击氧化应激的关键步骤，Nrf2通过调节Ⅱ相抗氧化酶在调节细胞氧化应激中发挥重要作用。此前研究表明［2］，姜黄素可以通过激活 Nrf2核转位，增加具有抗氧化功能的Ⅱ相代谢酶的合成，减低肝细胞氧化应激水平。本实验通过高脂饮食建立IR大鼠模型，用Nrf2诱导剂姜黄素进行干预，观察上调Nrf2表达对肝脏氧化应激及IR相关指标的影响，探讨Nrf2对IR的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 姜黄素购自美国Sigma公司;牛胆盐、胆固醇均购自北京奥博星生物技术责任有限公司;羧甲基纤维素钠、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒均购自南京建成生物有限公司;兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗HO-1多克隆抗体购自美国Abzoom公司;羊抗兔IgG抗体(二抗)购自北京博奥森公司。

1.2 动物及分组 清洁级SD雄性大鼠24只，12周龄，体重(200±30)g，由第四军医大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后随机分为对照组，模型组和姜黄素干预组各8只。对照组给予普通饲料，模型组及干预组给予髙脂饮食。6周末检测各组大鼠IR。之后对照组继续普通饲料喂养，模型组继续髙脂饮食喂养，干预组给予髙脂饮食加姜黄素灌胃200 mg/(kg·d)，共4周。

1.3 大鼠IR模型 参考钟岚等［3］方法配成高脂饲料(在普通饲料基础上加10%猪油、2%胆固醇及0.5%牛胆盐)。6周末用胰岛素－正常血糖钳夹术检测模型组IR。4%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，切开颈部皮肤暴露左颈动脉和右颈静脉并分别插管。将静置30 min的插管大鼠颈动脉取血，强生全血糖仪测定基础血糖值。颈静脉导管接三通管，另两端接胰岛素和葡萄糖输液管，恒速输注胰岛素，每5 min测定血糖一次。当血糖值超出基础值±0.5 mmol/L时，开始输注10%葡萄糖，调整葡萄糖输注速率(glucose input rat，GIR)，使血糖值控制在基础值±0.5 mmol/L。连续3次血糖值均稳定在上述范围，即达到稳态，持续上述过程达2 h并记录GIR。

1.4 观察指标方法

1.4.1 肝组织病理学检测 肝脏右叶留取部分组织，浸泡于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。

1.4.2 肝功能检测 大鼠心脏内取血，常规分离血清，用全自动生化分析仪检测ALT、AST的变化。

1.4.3 GSH和MDA的检测 大鼠血浆，按照试剂盒说明分别用紫外分光光度法在不同波长下测定GSH、MAD水平。

1.4.4 Western blot检测 Nrf2、JNK/p-JNK 和 IRS-1/p-IRS-1表达 取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜，封闭液中1 h，滴加抗Nrf2一抗(1∶1 000)4℃过夜，TBS/T洗3次(10 min/T)，二抗(1∶3 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜，方法同上，洗去游离二抗。NBT/BCIP显色，GelDoc凝胶成像仪采集图像。

2 结果

2.1 大鼠IR模型的建立 胰岛素－正常血糖钳夹实验显示模型组大鼠GIR［mg/(kg·min)］明显低于对照组大鼠(10.88 ±1.61vs21.88 ±1.72，P＜0.01)。

2.2 病理学变化 对照组大鼠肝脏无明显肿大，外观色泽呈红褐色，无明显异常;模型组大鼠肝脏明显肿大，外观色泽黄腻，偶可见局部白色变性灶，边缘圆钝，切面油腻;姜黄素干预组肝脏色泽、质地、体积较模型对照组均有所改善。光镜下观察，对照组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形;模型组大鼠部分肝细胞内可见脂滴聚积，见少量炎细胞浸润，多位于汇管区，以淋巴细胞为主;姜黄素干预组脂肪变性及炎症表现均轻于模型组。

2.3 血清 ALT、AST、MDA、GSH 变化 模型组ALT、AST、MDA 较对照组显著升高(P＜0.01)，姜黄素干预组ALT、AST、MDA较模型组显著降低(P＜0.01)，但干预组水平仍高于对照组(P＜0.01);模型组GSH较对照组显著降低(P＜0.01)，干预组GSH较模型组显著升高(P＜0.01)，但干预组仍低于对照组(P＜0.01，见表1)。

2.4 肝脏 Nrf2、JNK、p-JNK、IRS-1 和 p-IRS-1 变化对照组细胞核中Nrf2表达较少，模型组胞核中Nrf2表达较对照组有所增加，姜黄素干预组细胞核中Nrf2表达较对照组及模型组均明显增加。模型组的p-JNK水平较对照组增高，干预组p-JNK水平较模型组减少，介于模型组和对照组之间，JNK在各组间则未见明显变化;模型组的p-IRS-1水平较对照组减少，干预组p-IRS-1水平较模型组增高，但仍低于对照组水平;IRS-1各组间未见明显变化(见图1，表2)。

表1各组AST、ALT、MDA和GSH水平比较±s)Tab 1Comparison of AST，ALT，MDA and GSH among 3 groups(±s)

表1各组AST、ALT、MDA和GSH水平比较±s)Tab 1Comparison of AST，ALT，MDA and GSH among 3 groups(±s)

与对照组比较，#P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.01

AST/(U/L) ALT/(U/L) MDA/(nmol/ml) GSH/(mg/l)对照组 134.88 ±3.30 26.88 ±2.68 4.49 ±2.72 28.45 ±2.72模型组 240.13 ±8.93# 86.88 ±6.47# 7.61 ±0.44# 6.74 ±2.63#干预组 181.38 ±5.67#* 49.63 ±2.51#* 5.88 ±0.69#* 16.03 ±3.15#*

图1 Western blot检测肝脏 Nrf2、JNK/p-JNK和IRS-1/p-IRS-1的表达Fig 1 The expression of Nrf2，JNK/p-JNK and IRS-1/p-IRS-1 in liver tissues by Western-blot

表2 肝脏 Nrf2、JNK、p-JNK、IRS-1和 p-IRS-1的表达灰度值比较Tab 2 The grey degree of expression of Nrf2，JNK/p-JNK and IRS-1/p-IRS-1 in liver tissues

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病是一种无过量饮酒史、病变主体在肝小叶，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、NASH、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化4个病理类型。NASH是由单纯性脂肪肝发展至肝纤维化、肝硬化及肝癌的重要中间阶段，是一个关键的转折点［4］。IR常存在于NASH患者，IR相关性疾病如腹型肥胖、2型糖尿病及高脂血症常发生于NASH患者。

本实验通过髙脂饮食建立大鼠IR模型，并通过葡萄糖钳夹实验发现高脂饮食大鼠的GIR明显低于普通饮食大鼠，说明高脂饮食大鼠对胰岛素敏感性降低，存在明显的胰岛素抵抗。同时发现髙脂饮食可引起大鼠体内氧化应激水平增加。MDA作为脂质过氧化产物之一，可以反映体内脂质过氧化的程度。GSH的活性成份为还原型谷胱甘肽，参与体内氧化还原过程同时还可对抗自由基对重要脏器的损害，两者均反映机体氧化损伤程度。AST，ALT均反映肝脏组织受损程度。本实验结果模型组MDA、AST、ALT明显较对照组增加，干预组介于两者之间。模型组GSH较对照组降低，干预组介于两者之间。实验结果证实髙脂饮食可引起大鼠体内氧化应激水平增加，并进一步引起肝组织的氧化应激损伤。

有研究显示［5］高脂饮食引起的氧化应激是引起IR重要因素。氧化应激可以激活细胞内的一系列应激信号通道如JNK、PKC等。其中JNK通过作用于IRS-1减少胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化从而抑制胰岛素信号的转导［6］。本实验结果显示，模型组的JNK磷酸化水平较对照组增高，姜黄素干预组JNK磷酸化水平较模型组减少，介于模型组和对照组之间，非磷酸化的JNK各组间未见明显变化。模型组的IRS-1磷酸化水平较对照组减少，干预组IRS-1磷酸化水平较模型组增高，但仍低于对照组水平;非磷酸化的IRS-1各组间未见明显变化。实验结果证实髙脂饮食可导致氧化应激水平的增加，JNK通路的激活参与了IR的形成，髙脂饮食引起的氧化应激是IR发生的重要因素，姜黄素干预可明显减轻IR水平。

我们在前期研究中［7，8］证实通过诱导Nrf2核转位的增加，对氧化应激引起的肝细胞损害具有保护作用。研究表明［9，10］Nrf2是细胞抗氧化反应的中枢调节者。生理情况下它和胞质蛋白分子伴侣Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)结合使得活性处于相对抑制状态。当受到来源于活性氧或亲核剂的信号攻击后，Nrf2从Keap1中解离，然后稳定状态的Nrf2转位进入细胞核，与其他的bZIP蛋白结合成异二聚体，异二聚体与基因中的ARE结合转录后激活靶基因的表达，产生具有抗氧化作用的Ⅱ相酶从而在调节氧化应激中发挥重要作用。本实验结果显示Nrf2在细胞核中的表达对照组较少，模型组较对照组增加，干预组较对照组及模型组均明显增加。提示诱导Nrf2核转位可明显降低肝脏氧化应激水平，从而对肝脏起到保护作用。

本实验通过观察Nrf2诱导剂姜黄素对高脂饮食大鼠IR模型的影响，发现Nrf2核转位能够改善高脂饮食引起的肝脏组织学、IR及肝功改变，可能与Nrf2核转位上调Ⅱ相抗氧化的酶的表达，减轻肝脏氧化应激水平，进而降低JNK磷酸化水平、增加IRS-1磷酸化水平有关。本实验结果为以Nrf2为靶点进行NASH防治提供新的实验基础及理论依据。

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