李茂荣刘正湘

(1北京航天总医院心血管内科,北京 100076;2华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科,武汉 430030)

C反应蛋白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠血管平滑肌细胞 TNF-α表达的影响

李茂荣1刘正湘2＊

(1北京航天总医院心血管内科,北京 100076;2华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科,武汉 430030)

目的 构建小鼠C-反应蛋白基因重组质粒pIRES-CRP,观测其对血管平滑肌细胞 TNF-α表达的影响。方法用RT-PCR法,以小鼠肝组织RNA为模板,扩增获得编码C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的全长基因。将CRP基因克隆入真核表达质粒pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-CRP。将重组质粒转染 HeLa细胞,通过 RT-PCR法检测CRPmRNA的表达,Western blot检测CRP蛋白的表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,通过Western blot检测CRP对 TNF-α表达的影响。结果 经酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的CRP基因与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致,真核表达质粒pIRES-CRP构建成功。将重组质粒pIRES-CRP瞬时转染 Hela细胞,通过RT-PCR和Western blot证实CRP基因得到表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,TNF-α的表达明显高于空白对照组和空载体组(P<0.01)。结论 成功构建小鼠CRP基因重组质粒pIRES-CRP,CRP基因能在人子宫颈癌Hela细胞中正常转录和翻译,表达的蛋白能与CRP的特异抗体反应。CRP能明显上调小鼠血管平滑肌细胞 TNF-α的表达,这为解释CRP在冠状动脉的形成过程中起着促炎作用提供了新的实验依据。

小鼠肝细胞 ; 小鼠血管平滑肌细胞; C-反应蛋白; TNF-α; 基因表达

C-反应蛋白(CRP)是一种非特异性全身炎症标志物,与许多慢性疾病的发病机制有关,包括糖尿病(DM)、癌症、老年痴呆症、心血管(CV)疾病。事实上,全身循环高灵敏度C反应蛋白的测量一直作为动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、房颤、心肌炎、主动脉瓣疾病和心脏移植预后的一种指标。CRP主要由肝细胞合成,受白介素,TNF等炎症因子的调节。……