刘百祥，邵志清

(1.华东理工大学物理系，上海 200237;2.华东理工大学计算机科学与工程系，上海 200237)

随着人类对基因技术的研究日益深入，基因检测在卫生防疫、医学诊断、环境监测等领域的需求不断增大，基因检测的方法也越来越多。在众多的DNA检测技术中，DNA电化学传感器做为一种新的检测手段，与传统诊断技术相比，它以简单、快速、灵敏、廉价的方式获得大量序列特异性信息［1－3］，尤其是它的分子识别功能，在基因诊断、治疗和传染性疾病检测等方面具有广泛的应用前景。

电化学DNA传感器通常是通过电极表面连接电化学指示剂标记的ssDNA来识别与之互补的目标DNA序列，电化学指示剂是一类具有电化学活性的物质，通常使用二茂铁衍生物，还有邻苯二胺、阳离子金属复合物有机染料等。但它们往往同时与ssDNA和dsDNA 结合，选择性不理想［4－5］。亚甲基蓝(MB)是具有芳香杂环结构的化合物，它可以选择性地识别单、双链DNA，而且单、双链DNA电极的响应电流差别较大，是比较理想的电化学指示剂［6－8］。

图1 亚甲基蓝的分子结构

化学气相沉积法生成的金刚石薄膜电极作为一种良好的生物传感器基底电极，它以掺硼金刚石(Boron-Doped Diamond BDD)薄膜作为电极材料，而掺硼金刚石薄膜特殊的sp3键结构及其具有的导电性，赋予了金刚石薄膜电极优异的电化学特性［9－11］，如宽的电化学势窗、较低的背景电流、较好的物理化学稳定性以及较强的抗污染特性等，因此我们选用BDD做为本实验的工作电极。

制备电化学DNA传感器最重要的步骤就是探针DNA在基体电极上的固定，而对于惰性的金刚石电极来说就更是挑战。有关金刚石电极表面电化学处理及光化学处理连接探针DNA均有报道。Nebel等［12］将金刚石电极通过苯基重盐处理还原使之连接氨基基团，进而连接DNA;Hamers等［13］应用光化学的方法在金刚石电极共价连接氨基。虽然这种共价键和的方法固定的DNA相对稳定，但是过程复杂，制备时间较长，限制了它的应用。

二氧化锆特殊的分子结构使得其对含氧基团的分子(比如磷酸基)具有良好的生物亲合力，曾有氧化锆修饰的玻碳电极、碳纳米管电极、金电极、纳米金电极和碳糊电极上制备DNA电化学传感器的报道［14－18］，我们在试验中设计了一种非常简单、方便的固定探针DNA的方法，首先在掺硼金刚石薄膜电极表面电化学聚合一层氧化锆薄膜，将5'末端修饰磷酸基团的寡核苷酸短链(ssDNA)连接到氧化锆薄膜上。以亚甲基蓝(MB)为氧化还原的电子媒介体，应用循环伏安法(CV)和差分脉冲法(DPV)测试了该电极的性能。

1 实验部分

1.1 仪器

CHI 900 B电化学工作站(美国)，AutoLab电化学工作站(荷兰)，工作电极为掺硼金刚石电极，对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极。

1.2 试剂

氧氯化锆(ZrOCl2·8H2O)购自the Aldrich Chemical Co.，TE 缓冲液(pH 8)含 10 mmol Tris-HCl and 1 mmol EDTA，PBS缓冲液(pH 7.4)做为支持电解质(137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，10 mmol Na2HPO4，1.76 mmol KH2PO4)，所有其它试剂购自Sigma-Aldrich公司，所有溶液应用二次纯水(Millipore system)。

探针DNA(ssDNA)5'-PO4-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3'，靶向 DNA 5'-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3'，非靶向 DNA 5'-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA TGG ACT AAC AGG TTA TTC GAA-3'。购自Integrated DNA Technologies(IDT，Leuven Belgium)。

1.3 实验过程

1.3.1 金刚石电极处理

掺硼金刚石电极在使用前依次用0.3 μm、0.05 μm的A12O3粉末抛光成镜面(铝粉打磨设备购自Bioanalytical Systems)。抛光后电极用蒸馏水冲洗三次、然后用蒸馏水超声清洗6 min，再进行电化学清洗过程:在传统的三电极系统应用循环伏安法在0.1 mol/L硝酸溶液中处理20个循环(扫描电压2.4 V～－1.7 V vs.Ag/AgCl)，蒸馏水冲洗干净后备用。

1.3.2 电化学沉积二氧化锆

以处理好的金刚石电极为工作电极，银－氯化银电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，将此三电极系统置于5 mmol/L ZrOCl2水溶液中，支持电解质为0.1 mol/L KC1，在－1.1 V ～0.7 V 范围内以 20 mV/s循环伏安扫描，即得ZrO2/BDD电极。

1.3.3 DNA 的固定与杂交

将 ZrO2/BDD 电极浸入含 2.15×10－7mol/L ssDNA探针的2.0 mL Tris.HC1缓冲溶液中，于室温吸附1 h，取出后用超纯水清洗以除去未固定的ssDNA，得到ssDNA/ZrO2/BDD电极。将此电极置于含2.15×10－7mol/L 互补目标 DNA(cDNA)的杂交液中，室温杂交30 min，取出后PBS溶液冲洗，再用超纯水清洗以除去未杂交的 cDNA，即得双链 DNA(dsDNA)修饰电极，记为dsDNA/ZrO2/BDD电极。

电化学测量:以各修饰电极为工作电极，在1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1 ∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1溶液中，于CHI 900B工作站上记录其循环伏安曲线及差分脉冲曲线，实验在室温条件下进行，检测溶液为含1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1 溶液。

2 实验结果与讨论

在本次试验中选用表面光滑的掺硼金刚石电极，按照文献［19］介绍的方法经反复实验后确定如下电化学参数:应用循环伏安法在5 mmol ZrOCl2(含0.1 mol KCl支持电解质)－1.1 V ～0.7 V 间电化学沉积40个循环，扫描速率20 mV/s。结果如图2所示。由于二氧化锆是惰性的，随着电化学扫描的进行，还原电流的峰值不断减小，逐渐趋于稳定，电极表面形成超薄的多孔膜。完成全部扫描后电化学测试电极的大部分活性依然保留。

图2 电化学沉积氧化锆的循环伏安曲线

根据前面介绍的DNA的固定与杂交步骤，制得的DNA电化学传感器选择性能测试，通过探针DNA修饰的掺硼金刚石电极经与靶向DNA和非靶向DNA杂交后，再应用循环伏安法和差分脉冲法进行表征得到结果如图3。

图3 (a)probe-DNA/ZrO2/BDD电极；(b)ncDNA/

由图3可见，ss-DNA/ZrO2/BDD电极的还原峰电流远远大于ds-DNA/ZrO2/BDD电极的还原峰电流，这是因为probe-DNA的自由鸟嘌呤与亚甲基蓝的较强的结合力使得s-DNA/ZrO2/BDD电极表面积累的亚甲基蓝比较多，则还原峰电流较大。而DNA杂交后，自由鸟嘌呤大大减少，导致亚甲基蓝的峰电流亦随之降低。而与非靶向DNA杂交后电极的响应电流与ss-DNA/ZrO2/BDD电极的还原峰电流大小相近。表明电极选择性良好。

图4为差分脉冲法测得的电极杂交前后的响应曲线，结果与循环伏安方法得到的一致。所以，本试验方法制备的DNA电化学传感器选择性好，可显著识别特异的DNA序列。测试结果也证明了氧化锆薄膜修饰的电极表面由于氧化锆的特殊的分子结构可以用来固定带有磷酸基的探针DNA。

图4 差分脉冲法测得的工作电极杂交前后的响应曲线

图5所示为不同工作电极差分脉冲曲线，同样可见亚甲基蓝的峰电流随着靶向DNA的浓度增加而显著减少，通过测得不同靶向DNA浓度所对应的峰电流值，得到线性方程:

平行测定空白溶液11次的标准偏差为σ，根据3σ法计算此DNA电化学生物传感器以DPV法测得其检出限为7.55×10－12mol/L。

图5 不同浓度

图6 亚甲基蓝峰电流值与靶向DNA浓度的对数值关系图

3 结论

通过电化学方法沉积氧化锆多孔膜到掺硼金刚石电极表面，成功地将探针寡核苷酸短链固定至氧化锆分子上制成DNA电化学传感器，制作方法简单、方便。以亚甲基蓝为氧化还原指示剂测定了传感器的性能。由于硼掺杂的金刚石电极抗污染、背景电流非常小，而DNA与氧化锆的连接稳定，使得制备的电化学传感器表现出良好的选择性，电极线性范围宽，稳定性好。

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