董 萍,孙寓姣*,王红旗,陈利顶,张 辉(.北京师范大学水科学研究院,北京 00875；.中国科学院生态环境研究中心,北京 00085)

利用T-RFLP技术对温榆河微生物群落结构研究

董 萍1,孙寓姣1*,王红旗1,陈利顶2,张 辉1(1.北京师范大学水科学研究院,北京 100875；2.中国科学院生态环境研究中心,北京 100085)

利用T-RFLP技术(综合运用PCR技术、DNA限制性酶切技术和DNA序列自动分析技术)对温榆河不同尺度、不同时期的微生物群落结构进行了研究.从微生物的种类数、物种丰度、优势菌落、群落结构稳定性等方面特征着手,找出其优势群落;利用两种多样性指数(香侬一威勒多样性指数、辛普森多样性指数)探讨各种微生物群落结构的多样性以及同一群落随时间而发生的变化;比较了微生物指标与水质指标COD之间的变化关系.结果表明,温榆河不同尺度、不同时期的微生物具有明显变化,说明季节性变化对水体中微生物群落产生了明显的影响;T-RF67bp、151bp、440bp、481bp、488bp所代表的微生物群落体现其为优势种群; T-RF为135bp、151bp、440bp的微生物群落对于外界反映最敏感,验证其有可能能作为环境变化的指示性生物;微生物指标与COD呈现明显的正相关.

T-RFLP；微生态系统；群落结构；16S rRNA基因

微生物群落结构是研究微生物生态学最重要内容之一,自然界中 85%～99%微生物,以目前的条件还难以培养[1],而且一旦将这些有机体从环境中分离出来,微生物原有生存环境将被改变,因而所获得的信息无法准确地反映原始群落结构和微生物多样性[2].

近年来,随着分子生物学的发展,基于16SrRNA基因的非培养技术为揭示自然环境中微生物种类和遗传多样性开辟了一条全新的途径,摆脱了传统的分离培养方法不能完整反映生态系统全部信息的束缚.T-RFLP技术是将RFLP技术和荧光标记技术相结合后发展的一种较先进的分子生态学方法,由Liu等[3]于1997年首次应用于微生物群落多样性的研究.有研究认为[4],该方法适于微生物群落多样性中等或更低环境样品的多样性分析.

本实验应用 T-RFLP技术对温榆河不同时期和不同尺度的微生物群落结构进行分析,探讨微生物群落结构的内在规律.引入香侬一威勒多样性指数和辛普森多样性指数的分析方法,进一步明确各种微生物群落结构的相似性以及同一群落随时间而发生的变化,比较了微生物指标与水质指标的相关性,以确定水生态系统各要素之间的相互关系.

1 材料与方法

1.1 样点与采样方法

根据北京市水功能区划,温榆河上段(沙河水库-沙子营)、东沙河、北沙河、南沙河的水体功能为人体非直接接触的娱乐用水区,属于Ⅳ类水功能区,水质类别执行《地表水环境质量标准(GB3838-2002)》中的Ⅳ类标准.温榆河下段(沙子营～北关闸)水体功能为农业用水区及一般景观要求水域,属于Ⅴ类水,水质类别执行Ⅴ类标准.根据流域特点将温榆河划分为如下功能段:温榆河上段干流(沙子营以上)、北沙河东沙河、蔺沟河、温榆河下段干流(沙子营以下)清河上段、清河下段、坝河上段、坝河下段、小中河.在每个功能段布设 2～3个采样点.最终确定为:肖家河桥、温泉桥、温阳路临时点、前沙涧桥、稻香湖、上庄水库等 24个采样点(详见图1).分别在5～8月份进行4次采样,多数采样点采集水面以下约 0.5m处,在每个采样点采集5L水样.

水体主要理化性质的测定委托中国科学院生态环境研究中心完成.

图1 温榆河采样点分布示意Fig.1 The distribution map of sample sites

1.2 样品预处理和群落总DNA的提取

取 5L水样,在真空抽滤装置中通过 0.22µm孔径的滤膜过滤,滤膜上即留有水样中生物样品.将滤膜取出,剪取1/2,并剪碎放于2mL的灭菌离心管中,用DNA 提取试剂盒( Water DNA Kit –美科美生物医学科技中心)提取总 DNA并纯化,经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.3 引物设计与细菌的 16SrDNA的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction-PCR)扩增

本研究使用细菌通用引物[5]扩增细菌 16S rRNA 基因,在正向引物的 5’端标记荧光物质.PCR条件见表1.

8F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

表1 细菌荧光引物PCR反应条件Table 1 Polymerase chain reaction conditions of bacterial fluorescence primer

1.4 扩增产物的限制性酶切和T-RFLP分析

PCR产物用MSPI 37℃酶切.每50µL酶切体系中,加入 PCR 产物 20µL,限制性内切酶1.2µL、缓冲液4µL、剩余量由ddH2O补齐.酶切产物脱盐处理、基因扫描由北京诺赛基因公司完成.

2 结果与讨论

2.1 T-RFLP图谱分析

对不同时间的水体采样来考察微生物群落结构的空间变化,采取 5、6、7、8月份在沙河水库采样点的水样,提取水体中微生物群落总DNA,扩增细菌的16S rDNA,并通过T-RFLP分析,得到4个不同时间细菌群落的T-RFLP图谱,如图2所示(取DNA片段长度处于60～640bp[6-7],并且荧光强度超过 100RFU[8]的峰).可以直观看出四个采样点水体中的微生物群落结构都较为复杂,并且在一定程度上群落保持相对稳定,反映出水体生态系统本身的缓冲能力,这对于水体中微生物的活动具有重要意义.各细菌群落T-RFLP 图谱所显示的在 100～200bp、440～550bp之间菌群比较密集,T-RF为67bp、151bp、440bp、481bp所代表的细菌种群在所有样品中普遍占优势,可能为此区段微生物生态系统的优势种群.除此之外,T-RF135bp、151bp、440bp和481bp所代表的细菌种群有较为明显的变化,具体变化趋势如下:

5月份:占优势的细菌种群 T-RF长度是67bp、135bp、151bp、214bp、440bp、481bp、484bp、488bp.488bp仍保持相对优势,135bp、151bp、214bp逐渐增加,还出现了T-RF为92bp 147bp、285bp等的新种群.

7月份:135bp、151bp、214bp继续增加.

8月份:T-RF 为 67bp、135bp、151bp、440bp 481bp、484bp、488bp仍继续存在,其他逐渐消失.

从5月份至7月份再至8月份经历了一个微生物种群由少到多再到少的变化过程,由于春季自然降水较多,夏季较干燥;且8月有持续的超过33℃的高温天气,使的水体 pH、温度、COD 等发生变化.细菌群落的时间变化主要是由于水体理化性质变化引起.且T-RF为135bp、151bp、440bp所代表的细菌种群受外界影响最大,对于外界反映最敏感,有可能能作为环境变化的指示性生物.

为了进一步了解微生物群落在空间上的变化,在同一时期的采样中随机选取的 5个点进行对比分析(其T-RFLP图谱见图3),5个采样点水体中的微生物群落结构都较为复杂,并且同样在一定程度上群落保持相对稳定.T-RF67bp、151bp、440bp、481bp、488bp所代表的微生物群落仍占普遍优势,进一步体现其为优势种群.并且T-RF为135bp、151bp、440bp的细菌种群变化比较大,对于外界反映最敏感,进一步验证其有可能能作为环境变化的指示性生物.

同一时间的不同采样点水体微生物种群具有差异性,是由于周围人类活动间接影响到水体.

2.2 多样性指数

用多样性指数计算得到的微生物群落结构的多样性参数.通过比较该参数可以进一步明确各种微生物群落结构的相似性以及同一群落在空间水平和垂直以及随时间而发生的变化.

图2 5月、6月、7月、8月份在沙河水库的水样细菌群落T-RFLP图谱Fig.2 Bacterial 16S rRNA T-RFLP profiles of water samples at Shahe reservoir sampling points in different time

图3 同一时间在不同采样点水样的细菌群落T-RFLP图谱Fig.3 Bacterial 16S rRNA T-RFLP profiles of water samples at the same time at different sampling points

香侬-威勒(Shannon-Wiener)多样性指数

式中: ni为T-RFLP图谱中第i个峰的面积; N为TRFLP图谱中峰的总面积;S为T-RFLP峰的个数.

在香侬一威勒多样性指数中包含两个因素:①种类数目(即丰富度);种类中个体分配上的平均性或均匀性.种类数目多,可增加多样性;同样,种类之间个体分配的均匀性增加也会使多样性提高.

辛普森(Simpson)多样性指数(优势度指数)

式中: ni为T-RFLP图谱中第i个峰的面积;N为TRFLP图谱中峰的总面积; S为T-RFLP峰的个数.

图4 5月、6月、7月、8月香侬一威勒多样性指数Fig.4 Shannon-Wiener diversity index in different month

图4 、图5中显示温榆河各功能段20多个采样点水体微生物多样性指数相对稳定,两种指数(香侬一威勒多样性指数、辛普森多样性指数)变化范围分别在 2.75～4.75、0.81～0.98 之间,多样性复杂.5月份到6月份再到8月份采样点的两种多样性指数先增大再减小.

利用统计软件SPSS13.0对两种指数进行相关性分析(表 2),两种多样性指数的相关系数为0.864.表明,其存在显著的相关性.香侬一威勒多样性指数和辛普森多样性指数均可很好表征微生物多样性.

图5 5月、6月、7月、8月辛普森多样性指数Fig.5 Simpson diversity index in different month

表2 两种多样性指数之间的相关性Table 2 Correlations between results of Two kinds of diversity index methods

2.3 微生物指标与相应水质指标(COD)的变化

所谓化学需氧量(COD),是在一定的条件下,采用一定的强氧化剂处理水样时,所消耗的氧化剂量它是表示水中还原性物质多少的一个指标.水中的还原性物质有各种有机物、亚硝酸盐、硫化物、亚铁盐等.但主要的是有机物.申玉春等[9]提出虾池COD值与细菌数量间呈显著的正相关关系.

6月、7月、8月水体COD与其香侬多样性指数呈相同的变化趋势(图6),COD与香侬多样性指数的相关系数为 0.935,显著正相关,细菌是有机物的分解者,除少数自养菌外,绝大多数细菌都要以有机物作为生命活动的物质基础.而 COD值是水体中有机物含量的综合反应.因而细菌的数量和生长量必然与 COD值密切相关.微生物指标与更多水质指标的相关性还有待进一步研究.

图6 6、7、8月份香侬指数与COD变化关系Fig.6 The relationship between Shannon-Wiener diversity index and COD

3 结论

3.1 通过对温榆河微生物群落T-RFLP图谱空间变化(不同时间、不同地点)上的直观分析,显示水体中的微生物群落结构较为复杂,并且在一定程度上群落保持相对稳定.T-RF67bp、151bp、440bp、481bp、488bp所代表的微生物群落体现其为优势种群;T-RF为135bp、151bp、440bp的微生物群落对于外界反映最敏感,验证其有可能能作为环境变化的指示性生物.

3.2 分析了两种多样性指数(香侬一威勒多样性指数、辛普森多样性指数),显示各个采样点的两种多样性指数均比较大,并且5、6月份采样点的两种多样性指数普遍高于7、8月份,2种多样性指数存在显著地正相关,均可很好表征微生物多样性.

3.3 水体微生物指标与 COD呈现显著地正相关.说明微生物指标与水质指标一定程度上相关联,进一步的结论还有待研究.

[1] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J]. Microbiol Rev, 1995,59:143-169.

[2] 王洪媛,管华诗,江晓路.微生物生态学中分子生物学方法及T-RFLP技术研究[J].中国生物工程杂志, 2004(8):41-47.

[3] Liu W T, Marsh T L, Cheng H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA [J]. Appl.Environ. Microbiol., 1997,63(11):4516-4522.

[4] 袁三青,薛燕芬,高 鹏,等.T-RFLP技术分析油藏微生物多样性 [J]. 微生物学报, 2007,47(2):290-294.

[5] Claudia Moreno1, Jaime Romero1, Romilio T Espejo. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio [J].Microbiology, 2002,148:1233-1239.

[6] Edel-Hermann V, Dreumont C, Perez-Piqueres A, et al. Terminal restriction fragment length polymorphism analysis of ribosomal RNA genes to assess changes in fungal community structure in soils [J]. FEMS Microbiol. Ecol., 2004,47(3):397-404.

[7] Dunbar J, Ticknor L O, Kuske C R. Assessment of microbial diversity in four southwestern United States soils by 16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis [J]. Appl. and Environ Microbiol., 2000,66(7):2943-2950.

[8] Osborn A M, Moore E R B, Timmis K N. An evaluation of terminal–restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)analysis for the study ofmicrobial community structure and dynamics [J]. Environ. Microbiol., 2000,2(1):39-50.

[9] 申玉春,熊邦喜,叶富良,等.凡纳滨对虾高位池细菌数量变化及其与水环境因子的关系 [J]. 海洋科学, 2006,30(7):33-37.

Study of micro-ecosystem of the Wenyu River by terminal restriction fragment length polymorphism analysis.

DONG Ping1, SUN Yu-jiao1*, WANG Hong-qi1,CHEN Li-ding2(1.College of Water Sciences, Beijing Normal University,Beijing 100875, China；2Research Center for Eco-environmental Sciences, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：631～636

The micro-ecology of Wenyu River in different scales and periods was researched by T-RFLP method. We found its dominant communities based on several factors: the number of species, species abundance, dominant colonies,the stability of community structure of the micro-organisms, etc. And then we studied the diversity of every microbial community structures, as well as the variation over different times of the same one community. Finally, we examined the relevance between the microbial indicators and water quality objectives(COD).Results indicate the number of microbe in Wenyu River had significant changed in different scales and periods, also show that seasonal changes had an apparent impact on microbial communities in water .Microbial communities of T-RF67bp, 151bp, 440bp, 481bp, 488bp represent the dominant species in river; T-RF135bp, 151bp, 440bp are most sensitive to environment, suggesting they may act as indictors of environment changing. The relationship between Microbial indicators and cod presents positive correlation.This study is the foundation to further understand the structures and functions of whole ecology system.

T-RFLP；micro-ecosystem；community structure；16S rRNA gene

X172

A

1000-6923(2011)04-0631-06

2010-08-02

国家“十一五”重大科技专项子课题(2008ZX07526-002-02);国家自然科学基金资助项目(50708008)

* 责任作者, 副教授, sunyujiao@bnu.edu.cn

董 萍(1986-),女,山东潍坊人,硕士研究生,主要从事环境微生物、污水处理生物技术、生物清洁能源的研究和技术开发.发表论文1篇.