袁 伟，陆晓和，宫玉波，周 瑾

免疫排斥反应是导致角膜移植尤其高危角膜移植失败的主要原因。深入探讨排斥反应发生机理，通过多种手段及途径抑制角膜移植免疫排斥反应的发生，仍是眼科领域关注的焦点之一。近年来，利用基因治疗技术将抑制免疫排斥反应的基因转入角膜防治移植免疫排斥反应成为很有希望的新手段，其中，RNA干扰（RNAi）作为一种新兴的基因阻断技术，以其简单、有效、特异地下调细胞中基因的表达等优势，在人类基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景[1-3]。

本研究利用RNA干扰及转基因技术，采用球结膜下注射途径，将携带有报告基因GFP的针对大鼠共刺激分子ICOS为目的基因的Ad-siICOSEGFP应用至大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，观察Ad-siICOS-EGFP对大鼠植片存活时间的影响、抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反应的效果，初步探索以ICOS为目的基因的RNAi技术用于防治角膜移植免疫排斥反应的可行性及有效途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级Wistar大鼠30只为供体，SD大鼠60只为受体，雌雄不限，体质量200～250 g，鼠龄2～3个月，南方医科大学实验动物中心提供（实验动物质量许可证号：0033674）。动物饲养温度为 22～25℃，湿度为（50±5）%。

1.2 主要试剂 Ad-siICOS-EGFP（携带报告基因绿色荧光蛋白且表达ICOS-siRNA的重组腺病毒载体）溶液（北京本元正阳基因有限公司提供），物理滴度：3.7×1011v.p./ml；Ad-EGFP（携带报告基因绿色荧光蛋白的重组腺病毒）溶液（北京本元正阳基因有限公司提供）， 物理滴度：2.3×1011v.p./ml；30 g/L戊巴比妥钠溶液（南方医院实验动物中心提供）。

1.3 方法

1.3.1 球结膜下注射 腹腔注射30 g/L戊巴比妥钠溶液1.5 ml/kg麻醉，缝线开右睑，在手术显微镜下，选取角膜缘12点位、6点位处2个注射点，以微量进样器于近角膜缘球结膜下分别进行注射溶液，注射时缓慢推注溶液，使其在球结膜下弥散。

1.3.2 动物模型的建立及手术方法 以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，参照文献[4]方法。术前20 min以0.5%托品酰胺滴眼液散瞳，腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液1.5 ml/kg麻醉。术前消毒，常规无菌操作，在手术显微镜下进行。首先于供体角膜中央区钻取直径为3.5 mm植片，置于Healon中备用。在受体大鼠右眼行穿透性角膜移植术。做上下眼睑牵引线，用直径3.0 mm环钻钻取中央区角膜，将植片置于植床，以10-0尼龙丝线间断缝合8针，线结暴露不包埋。手术做部分改进，以粘弹剂Healon代替平衡盐液，维持前房。术毕散瞳，结膜下注射庆大霉素2000 U，结膜囊涂四环素眼膏，缝合睑缘。24 h后，拆除睑缘缝线观察角膜植片情况。角膜缝线在整个观察期内不拆除。

1.3.3 实验分组 根据注射途径和注射溶液的种类不同进行分组。所有受体大鼠随机分为以下3组，每组20只鼠：A组为单纯角膜移植对照组；B组为Ad-siICOS-EGFP注射组，术后即刻于每个球结膜注射点分别注射 Ad-siICOS-EGFP15 μl；C 组为Ad-EGFP注射组，术后即刻于每个球结膜注射点分别注射 Ad-EGFP15 μl。

1.4 术后裂隙灯观察及评分 术后第1天开始在裂隙灯显微镜下进行临床观察，参照Larkin等[5]的评分标准，记录每日排斥反应指数（rejection index，RI），当RI＞5或植片混浊一项达到 3时，即认为排斥反应发生。

1.5 术后取材及处理 各组大鼠分别于术后第5天随机取10只大鼠，麻醉后取角膜，部分行RTPCR检测；部分角膜冰冻切片行共聚焦显微镜观察。各组其余大鼠进行角膜植片存活时间统计。

1.6 共聚焦显微镜观察GFP表达情况 摘取角膜后，冰冻切片机连续切片，厚度8 μm，激光共聚焦显微镜观察荧光表达，以蓝光激发GFP，观察并摄片。

1.7 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，应用SPSS13.0统计软件包进行处理。统计方法：四组均数比较应用单向方差分析（one-way ANOVA），样本均数间的多重比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 术后裂隙灯观察及植片存活时间 60只SD大鼠接受同种异体穿透性角膜移植手术。其中52只大鼠角膜移植术后术眼前房形成良好，晶状体透明，未见手术并发症。8只被排除于观察组外，其中5只为术中麻醉意外死亡，1只术后出现前房消失，2只出现并发性白内障。均当即补充实验动物。各组植片平均存活时间：A 组（9.800±0.632） d；B 组（14.700±1.418） d；C 组（10.000±1.054）d。 各组间角膜植片平均存活时间比较，有统计学差异 （F=52.383，P=0.000）。多重比较结果：B组与其余各组相比均有统计学差异 （P值均<0.05）；A组、C组组间无统计学差异。B组角膜植片平均存活时间最长。

2.2 共聚焦显微镜观察GFP表达情况 球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP组 （B组）及球结膜下注射Ad-EGFP组（C组）角膜植片可见绿色荧光表达，表达位于角膜上皮层及整个角膜基质层（图1）。A组角膜植片未见绿色荧光表达。

图1 GFP荧光蛋白在B、C组角膜上皮层及基质层的表达（×400）

3 讨 论

角膜移植的免疫排斥反应主要是T细胞介导的迟发性超敏反应，随着分子生物及免疫学的不断发展，对其具体机制有了一定的认识，但仍尚未完全阐明。T细胞的活化需要两种不同的刺激信号[6]，第一信号由抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）MHC-抗原肽复合物和T细胞上的TCR-CD3结合提供；第二信号即共刺激信号，由APC表面表达的共刺激分子与T细胞上的相应受体作用产生。目前已知的共刺激分子有多种，主要是B7家族成员和CD28家族成员，可诱导共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）是 CD28 家族的新成员，有实验表明，ICOS/ICOSL共刺激通路与大鼠角膜移植免疫排斥反应有密切关系[7]。

RNA干扰 （RNAi）是一种新兴的基因阻断技术，具有能够简单、有效、特异地下调细胞中基因的表达等特点，广泛应用于多种疾病的研究中[8]。故本研究利用RNA干扰及转基因技术，将针对大鼠共刺激分子ICOS为目的基因的Ad-siICOS-EGFP采用球结膜下注射的方式转染至大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，观察Ad-siICOS-EGFP对大鼠植片存活时间的影响，推断阻断ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反应的效果，初步探索以ICOS为目的基因的RNAi技术用于防治角膜移植免疫排斥反应的可行性及有效途径。

本实验建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，设立单纯角膜移植组、球结膜下注射AdsiICOS-EGFP组、球结膜下注射Ad-EGFP组。研究发现：球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP组角膜植片存活时间最长，与其他各组相比均有统计学差异，但植片仍不能长期存活。

以上结果说明，Ad-siICOS-EGFP可以通过阻断ICOS共刺激通路，一定程度上抑制角膜移植急性免疫排斥反应，保护角膜移植物。但研究也发现，球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP组受体鼠移植角膜未能长期存活，说明角膜移植排斥反应是一个多因素参与的复杂过程，共刺激途径多样化，单纯阻断ICOS一个共刺激通路虽然能够较好的抑制急性排斥反应的发生，延长移植物存活时间，但不足以诱导稳定、持久的免疫耐受，植片未获得长期存活。更有效的抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的方法仍有待进一步研究。

[1]Annette Busch,Wayne A Marasco,Cornelia Doebis,et al.MHC class I manipulation on cellsurfaces by gentransfer of anti-MHC class I intrabodies-a tool for decreased immunogenicity of allogeneic tissue and cell transplants[J].Method,2004,34:240-249.

[2]Comer RM,King WJ,Ardjomand N,et al.Effect of administration of CTLA4-Ig as protein or cDNA on corneal allograft survival[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(6):1095-1103.

[3]Sato Y,Ajiki T,Inoue S.Gene silencing in rat-liver and limb grafts by rapid injection of small interference RNA[J].Transplantation,2005,27(79):240-243.

[4]Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneal transplantation in the inbred rat:a new model.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26(1)：23-30.

[5]Larkin DFP，Calder VL，Lightman SL.Identification and characterization of cells infiltrating the graft and aqueous humor in rat corneal allograft rejection[J].Clin Exp Immunol，1997，107(4)：381-391.

[6]Djukanovic R.The role of costimulation in airway inflammation[J].Clin Exp Allergy,2000,30(suppll):46-50.

[7]袁 伟，陆晓和，宫玉波，等.ICOS共刺激通路参与角膜移植免疫排斥反应的研究[J]. 眼科研究，2009，（4）：27.

[8]Storz G.An expanding universe of noncoding RNAs[J].Science,2002,296(5571):1260-1263.